通用型柱式DNA提取试剂盒说明书

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

北京百奥莱博主要从事生物试剂的生产和销*(代"售")，产品线涵盖通用型柱式DNA提取试剂盒说明书在内的分子生物学试剂产品，还包括PCR及荧光定量PCR、核酸提取试剂盒类、样本核酸保护试剂、核酸提取、克隆与转化、蛋白纯化、蛋白检测、免疫组化、细胞凋亡与抗体等。

名称：通用型柱式DNA提取试剂盒说明书
产地：国产|进口
品牌：百奥莱博
编号：WE0190
英文名：Universal Genomic DNA Extraction Kit
规格：50次|200次
  本试剂盒适合于从新鲜或冷冻的动物组织、细胞、血液、细菌等多种样品中提取高纯度总DNA。本品可纯化获得分子量最大为50 kb的DNA片段，纯化过程不需使用*酚或*仿等有毒溶剂，无需乙醇沉淀。本试剂盒采用优化的缓冲体系使裂解液中的DNA高效特异的结合到硅基质离心吸附柱上，PCR和其他酶促反应的抑制剂可通过两步洗涤步骤被有效去除，最后使用低盐缓冲液或水洗脱，即可得到高纯度DNA。纯化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文库构建、Southern Blot、分子标记等下游实验。

试剂盒组成：

 

组份	50次	200次
Buffer GTL	15ml	60ml
Buffer GL	15ml	50ml
Buffer GW1(浓缩液)	13ml	52ml
Buffer GW2(浓缩液)	15ml	50ml
Buffer GE	15ml	60ml
蛋白酶K	25 mg	90 mg
蛋白酶K 储存液	1.25ml	5ml
吸附柱DM及收集管	50套	200套

自备试剂：无水乙醇，Enzymatic Lysis Buffer(提取革兰氏阳性菌基因组DNA时须准备)。
Enzymatic Lysis Buffe配方：20 mM Tris，pH8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2% Triton X-100；终浓度为20 mg/ml的Lysozyme(溶菌酶)。

实验前准备及重要注意事项/strong>：
1．向蛋白酶K 中加入指定用量(1.25ml|4.5ml)的蛋白酶K 储存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。
2、样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。
3、如果提取次生代谢产物大量积累或细胞壁厚的细菌培养物的基因组，建议在对数生长期早期收集样品。
4、第一次使用前应按试剂瓶标签的说明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。
5、使用前请检查Buffer GTL和Buffer GL是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将Buffer GL和Buffer GTL于56℃水浴重新溶解。
6、如果下游实验对RNA污染比较敏感，可以在加入Buffer GL前加入4μl DNase-Free的RNase A(100 mg/ml)，RNase A 本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，货号：WE0225S。

操作步骤：

一、血液及细胞样本基因组提取：
1、材料处理
a. 如果提取材料为哺乳动物抗凝血液(无核红细胞)，可直接向50-200μl新鲜或冷冻的抗凝血液样品中加入Buffer GTL补足至200μl；
b. 如果提取材料为禽类、鸟类、两栖类或更低级生物的抗凝血液，其红细胞为有核细胞，取5-10μl新鲜或冷冻的抗凝血液样品，加入Buffer GTL补足至200μl；
c. 贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液(最大提取量为5×106个细胞)，2000rpm(400×g)离心5分钟，弃尽上清，加200μl GTL，振荡至样品彻底悬浮；注意：如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl浓度为100 mg/ml的RNase A溶液(货号：WE0225S)，涡旋15秒，室温放置2分钟。
2、加入20μl 蛋白酶K 。
3、加入200μl Buffer GL，涡旋震荡充分混匀，56℃水浴10分钟。
4、短暂离心以去除管盖内壁的水珠。加入200μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀，短暂离心。
注意：
1)加入Buffer GL和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。
2)加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。一些组织在加入Buffer GL和无水乙醇后可能形成溶胶状产物，此时推荐进行剧烈震荡或涡旋处理。
5、上一个步骤中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱DM中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm(～～13400 ×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤7。
8、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。
9、将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μlBuffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
注意：
1)如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0时洗脱效率不高。
2)Buffer GE在65-70℃水浴预热，离心之前室温孵育5分钟可以增加产量；用另外的50-200μl Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
3)如果要提高DNA的终浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟；若洗脱体积小于200μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1μg，推荐用50μl Buffer GE或灭菌水洗脱。
4)因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。

二、动物组织基因组提取：

1、材料处理
 如果提取材料为动物组织，取25 mg(脾组织用量应少于10 mg)；如果材料为鼠尾，取一段长度为0.4-0.6 cm的大鼠鼠尾或两段长度为0.4-0.6 cm的小鼠鼠尾。
a. 样本进行液氮研磨或切成小块后置于1.5ml离心管中，加入180μl Buffer GTL，将不同样品做好标记。
b. 若使用匀浆器处理样本，匀浆前向样本中加入不超过80μl Buffer GTL，匀浆后加入100μl Buffer GTL。
注意：
1)确保各组织的量不要超出推荐范围。
2)组织样本在加入Buffer GTL之前用液氮研磨或加入Buffer GTL用匀浆器匀浆处理，可以增加裂解效率。
2、加入20μl 蛋白酶K ，涡旋震荡使样品彻底混匀。56℃水浴，直至组织完全裂解，孵育过程中可每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样品分散。
注意：
1)不同组织消化时间不同，通常1-3小时即可完成，鼠尾需要消化6-8小时，必要时过夜消化，不会影响后续操作。
2)如果孵育和涡旋震荡后仍然有胶状物质，延长56℃孵育时间或再加入20μl 蛋白酶K 消化。
3)如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl的浓度为100 mg/ml的RNase A溶液(货号：WE0225S)，涡旋15秒，室温放置5-10分钟。
3、加入200μl Buffer GL，涡旋震荡充分混匀，70℃水浴10分钟。短暂离心后加入200μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。
注意：
1)加入Buffer GL和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。
2)加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。一些组织(如脾，肺)在加入Buffer GL和无水乙醇后可能形成溶胶状产物，此时推荐进行剧烈震荡或涡旋处理。
4、短暂离心，将步骤3所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱DM中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm(～～13400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
5、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤6。
7、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。
8、将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μlBuffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
注意：
1)如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0时洗脱效率不高。
2)Buffer GE在65-70℃水浴预热，离心之前室温孵育5分钟可以增加产量；用另外的50-200μl BufferGE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
3)如果要提高DNA的终浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟；若洗脱体积小于200μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1μg，推荐用50μl Buffer GE或灭菌水洗脱。
4)因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。

三、细菌基因组提取：
1、细菌样本预处理
a. 革兰氏阴性菌
①取细菌培养物1-5ml(106-108个细胞，最多不超过2×109个细胞)置于离心管(自备)中，12000rpm(~～13400 ×g)离心1分钟，尽量吸净上清。
②向沉淀中加入180μl Buffer GTL，振荡使菌体重悬。
③加入20μl 蛋白酶K ，涡旋混匀，56℃孵育，直至菌体完全裂解，孵育过程中每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样本分散。
注意：如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl浓度为100 mg/ml 的RNase A溶液(货号：WE0225S)，震荡混匀，室温放置5-10分钟。
④加入200μl Buffer GL，涡旋震荡混匀。
b. 革兰氏阳性菌
①取细菌培养物1-5ml(106-108个细胞，最多不超过2×109个细胞)置于离心管(自备)中，12000rpm离心1分钟，尽量吸净上清。
②加入180μl Enzymatic Lysis Buffer(自备)使菌体重悬。
③37℃孵育30分钟。
④加入20μl 蛋白酶K 涡旋震荡，充分混匀。加入200μl Buffer GL，涡旋震荡混匀。56℃孵育30分钟。
注意：
1)如果需要，95℃孵育15分钟可以使病原体失活，但是95℃孵育会造成一些DNA的降解。
2)如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl浓度为100 mg/ml 的RNase A溶液(货号：WE0225S)，震荡混匀，室温放置5-10分钟。
2、加入200μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。
注意：加入无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。
3、将步骤2所得溶液(包括形成的沉淀)全部加入到已装入收集管的吸附柱DM中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
4、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
5、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤5。
6、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。
7、将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μlBuffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
注意：
1)如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0时洗脱效率不高。
2)Buffer GE在65-70℃水浴预热，离心之前室温孵育5分钟可以增加产量；用另外的50-200μl Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
3)如果要提高DNA的终浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟；若洗脱体积小于200μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1μg，推荐用50μl Buffer GE或灭菌水洗脱。
4)因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。

储存条件：室温(15～30℃)。

关于通用型柱式DNA提取试剂盒说明书的更详细说明，请致电我公司咨询，我们将以最饱满的热情为您提供解答，此外，我公司专业供应下列产品：
*化胆固醇 TDZ 910-31-6
PY02-415  WORT琼脂  250克  
BL0828 HRP标记兔抗亲和素抗体
ARB10449 人电子转移黄素蛋白β肽(ETFB)含量测试 Human electron-transfer-flavoprotein beta polyPeptide,etfb ELISA KIT
ARB13046 小鼠尿激酶(UK)Elisa定量检测 Mouse urokinase，uk ELISA KIT
ARB13146 小鼠活化蛋白C(APC)ELISA检测服务 Mouse activated protein c,apc ELISA KIT
ARB10085 人CXC趋化因子受体3(CXCR3)代做ELISA实验 Human cxc-chemokine receptor 3,cxcr3 ELISA KIT
BTN120510 ATP依赖的Dnase ATP Dependent Dnase
ARB10733 人纤调蛋白(FMOD)酶标法分析 Human fibromodulin,fmod ELISA KIT
ARB13700 兔阿霉素(ADR)检测服务 Rabbit adramycin,adr ELISA KIT
7725-54-0 Ammonium Persulfate   过硫*(代"酸")胺
BL1184 亲和层析柱50ml(2.5*16)
NF-238 兔抗鼠IgG血清
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盐*(代"酸")*丙林 Arginine Sepharose 4B 137-88-2
ARB12353 大鼠阿立新A(OrexIn A)酶免分析 Rat orexin a ELISA KIT
BTN131228 Tth 核酸内切酶 IV Tth Endonuclease IV
ARB10800 人抗可提取核抗原抗体(ENA-Ab)ELISA代测服务 Human anti-extractable nuclear antigen antibody,ena-ab ELISA KIT
ARB13944 猪促卵泡素(FSH)检测服务 Porcine follicle-stimulating hormone,fsh ELISA KIT
酸性磷酸酶 Silver bromide 9001-77-8
H1201 驴血浆(去红细胞、无菌过滤) 100ml/200ml/500ml/500ml*20瓶
CYB163077 溶菌酶-FITC(订制)
2-*基吖啶酮 dFdCyd 27918-14-5
ARB13847 猪巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α/CCL3)ELISA检测服务 Porcine macrophage inflammatory protein 1α,mip-1α ELISA KIT
4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷 LPS 6160-80-1
ARB12799 小鼠β*基己糖苷酶A(β-Hex A)含量测试 Mouse β-hexosaminidase a,β-hex a ELISA KIT
F030306 胶体金标记兔抗牛酪蛋白抗体 Rabbit Anti-casein*GOLD
D-正缬*酸 Chitodextrinase 2013-12-9
ARB10279 人大肠癌专一抗原3(CCSA-3)免费代测 Human colon cancer-specific antigen-3,ccsa-3 ELISA KIT
F030433 胶体金标记山羊抗人IgG(H+L)抗体 Polyclonal Goat Anti-Human IgG*GOLD
BTN100847 BCIP-NBT法杂交检测试剂盒 BCIP-NBT DIG Detection Kit
KG204 血液直接PCR试剂盒
ARB13611 兔子组织多肽抗原(TPA)elisa测定使用说明书 Rabbit tissue polyPeptide antigen,tpa ELISA KIT
BTN130530 His标签蛋白专用蛋白酶抑制剂 Protease Inhibitor for His-tagged Protein
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·BaldStar TaqMan Mixture(dUTP+UNG酶)(高含量ROX校正染料)
编号：WE0156
英文名称：BaldStar TaqMan Mixture(dUTP+UNG)(High ROX)
规格：5ml
  本品是专用于探针法(TaqMan，Molecular Beacon等)实时荧光定量PCR的预混体系，浓度为2×，包含 BaldStar Taq DNA polymerase、PCR Buffer、dNTPs(dTTP全部被dUTP所取代)、UNG酶和Mg2+，操作简单方便。主要用于基因组DNA靶序列和RNA反转录后的cDNA靶序列的检测，如基因表达分析，拷贝数分析，SNP基因型分析等。本产品中运用了dUTP-UNG防污染系统，在PCR反应体系配制过程中加入了dUTP，因此就形成了含有dU碱基的扩增产物。而此产物可以在下次进行PCR反应前，由PCR体系中的UNG酶处理消除。这样就有效的去除了PCR产物的残留污染，大大降低了由于扩增产物污染而导致的假阳性。UNG酶在PCR循环中的预变性步骤即可被灭活，因此不会影响新的含dU碱基PCR产物的形成。本品含有的 BaldStar Taq DNA Polymerase是一种经化学修饰的、全新高效热启动酶，在常温下没有聚合酶活性，有效避免在常温条件下由引物和模板非特异性结合或引物二聚体而产生的非特异性扩增，酶的激活须在95℃下孵育10分钟。独特的 PCR缓冲体系与热启动酶的组合，显著提高了PCR的扩增效率，荧光信号更强，灵敏度更高，可以检测单拷贝的模板。使用本产品可以得到更广的线性范围，对目的基因定量更准确。

  ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR 扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同，因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
不需要ROX校正的仪器(WE0154)：
Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96等。
需要Low ROX校正的仪器(WE0155)：
ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio® 3 System，QuantStudio® 5 System，QuantStudio® 6 Flex System，QuantStudio® 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
需要High ROX校正的仪器(WE0156)：
ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

产品组成：

组份	WE0154-5ml	WE0155-5ml	WE0156-5ml
2×BaldStar TaqMan Mixture(UNG)	5×1ml	5×1ml	5×1ml
50×Low ROX	-	200μl	-
50×High ROX	-	-	200μl
ddH2O	5×1ml	5×1ml	5×1ml

注意事项：
1、使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2、避免反复冻融本品，反复冻融可能使产品性能下降。本产品长期保存可置于-20℃，避光。如果在短期内需要频繁使用，可在2～8℃保存。


使用方法：
以下举例为常规PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系

试剂	50μl反应体系	终浓度
2×BaldStar TaqMan Mixture(UNG)	25μl	1×
Forward Primer，10μM	1μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	1μl	0.2μM
Probe，10μM	1μl	0.2μM
Template DNA	2μl
50×Low ROX or High ROX(可选)	1μl	1×
ddH2O	up to 50μl

注意：
1)通常引物浓度以0.2μM可以得到较好结果，可以在0.1-1.0μM作为设定范围的参考。
2)使用的探针浓度，与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。
3)通常DNA模板的量以10-100ng基因组DNA或1-10ng cDNA为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。
4)不同仪器的激发光学系统有所不同，根据使用荧光定量的仪器选择加入50× Low ROX or 50×High ROX。

2、PCR反应程序
注意！本产品预变性反应必须在95℃ 10分钟下完成！

两步法PCR：

步骤	温度	时间	循环数
UNG酶消化	37℃/50℃	2-10 min
预变性	95℃	10 min
变性	95℃	15 s	35-40个循环
退火/延伸	60℃	1 min

注意：
1)本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、10 min条件下实现酶的活化。
2)建议采用两步法PCR反应程序，若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增。

三步法PCR：

步骤	温度	时间	循环数
UNG酶消化	37℃/50℃	2-10 min
预变性	95℃	10 min
变性	95℃	15 s	35-40个循环
退火	55℃-65℃	30s
延伸	72℃	30s

储存条件：-20℃，避免反复冻融

北京百莱博科技有限公司专业生产供应销*(代"售")生物试剂、化学试剂、抗原抗体、血清血浆、Elisa试剂盒，更多试剂产品需求，欢迎来电咨询选购通用型柱式DNA提取试剂盒说明书。