Pfu DNA Polymerase

本公司生产的Pfu DNA Ploymerase是从克隆有Pyrococcusfuriosis DNA Ploymerase基因的大肠杆菌中表达并经过柱纯化分离出来的重组蛋白，其分子量为90kDa。由于Pfu酶具有3’→5’核酸外切酶活性，它能纠正DNA扩增过程中产生的错配，而传统的Taq酶却不能，其它耐热DNA Polymerase如Vent、Deep Vent、Tli、UITma等虽具有校正功能，但Pfu酶是目前已发现的所有耐热DNA Polymerase中出错率低的。Pfu酶无5’→3’核酸外切酶活性，PCR反应中的延伸速度一般为0.5-1kb/分钟，比Taq酶要低。Pfu 酶比Taq酶热稳定性更，95℃ 1小时仍保持90%以上的活性，对于GC含量很高的模板，变性温度可以提高到98℃而不影响其活性。Pfu酶的PCR产物为平末端，可加A处理再与T-载体连接或使用平末端克隆载体。一般用于DNA的高保真扩增，如基因表达克隆、基因定点突变、细胞内基因点突变分析(SNP)和末端补平等。

Pfu来源：表达Pfu DNA聚合酶的大肠杆菌。
Pfu酶储存缓冲液：50mMTris-HCl，pH 8.2；0.1mM EDTA；1mM DTT；0.1% Nonidet P40；0.1% Tween 20；50% 甘油。
Pfu单位定义：在74℃条件下，30分钟内催化10 nmmoldNTP的掺入反应成为酸不溶性物质所需要的酶量为一个单位。
Pfu用途：1）常规PCR反应中的DNA高保真体外扩增；
2）基因定点突变和拼接。
Pfu注意事项：
1、 酶浓度：建议在50ml的体系中使用1.25个单位的Pfu DNA聚合酶，因为酶存在3’-5’外切酶活性，高浓度的酶可能会增加降解引物的可能性。在加完dNTP后再添加Pfu DNA聚合酶。并在有冰浴的条件下混合PCR反应中的各种成分。
2、延伸时间：Pfu DNA聚合酶的延伸速率低于Taq DNA聚合酶，大约为一分钟600个碱基（Taq DNA聚合酶大约为一分钟2000个碱基），因此建议扩增1Kb的DNA用两分钟的延伸时间。对于大多数的反应而言，25～35个扩增循环就足够了。
Pfu保存：-20℃保存至少一年。