BTN100828型高pH缓冲液套装厂家价格

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名称：BTN100828型高pH缓冲液套装厂家价格
英文名：High pH Buffer Set
规格：30次
编号：BTN100828
产地：国产|进口
本产品用于Native-PAGE(非变性聚丙*(代"烯")酰胺凝胶电泳)分离大多数蛋白质，这些蛋白在此条件下一般都向阳极移动。本产品的特点是即开即用，省去用户单独配置每种溶液的麻烦。

产品组成：

 

成份	规格(30次*)
4×浓缩胶配胶液(pH6.7)	100ml
4×分离胶配胶液(pH8.9)	200ml
高pH电泳液(pH8.3)	10L(干粉)
5×高pH上样液	1ml
使用手册	1份

*注：1次是指的一次mini-Gel电泳

储存条件：常温运输及保存(5×高pH上样液需要-20℃保存)，有效期为一年。

欲咨询购买BTN100828型高pH缓冲液套装厂家价格，请致电北京百奥莱博科技有限公司，为您提供最全面周到的产品服务，除此之外，我公司正在促销以下产品：

·酵母DNA提取试剂盒
编号：BTN130990
英文名称：Yeast DNA extraction kit
规格：50次

·重组蛋白A
编号：BTN131079
英文名称：Staphylococcal protein A
规格：1mg
本品为重组蛋白A，分子量32kD，纯度＞90%，带His标签。

储存条件：-20℃保存，有效期1年。

·一管式点突变试剂盒
编号：BTN100212
英文名称：One-Tube Mutagenesis Kit
规格：10次
基因的定点突变是重要的分子生物学技术，广泛用于载体构建、基因改造、蛋白质功能研究等领域。但传统的方法需要使用单链DNA 模板，而得到单链DNA 模板又需要先将基因克隆到类似M13 这种载体中，操作过程冗长。为了克服这些缺点，本公司将突变位点设计到一对互补的引物中，用高保真扩增质粒模板，然后用Dpn I 去除原始的甲基化模板，新合成的DNA 通过互补形成带切口的双链质粒，直接用于转化感受态细菌。

产品特点：
1. 直接使用质粒DNA作为模板，免去了制备单链DNA的步骤。
2.基于高保真PCR，对模板DNA 序列没特殊要求，可以用于突变任何序列。同时对模板的需求量很少。
3.一管式，全部在一个优化的缓冲体系中完成，非常简单。
4. 使用Dpn I 去除未突变模板，突变效率高达90%。
5.可用于制备点突变，缺失突变和插入突变。
6. 本产品A型适用于8 kb以下，B型适用于8-15 kb。

试剂盒组成：

成分	10T(A型)	10T(B型)
高保真酶A型	10μl	无
高保真酶B型	无	10μl
5×高保真酶Buffer A型	100μl	无
5×高保真酶Buffer B型	无	100μl
dNTP(2.5mM each)	50μl	50μl
Dpn I酶	10μl	10μl
超纯水	1ml	1ml

储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、引物设计及注意事项
用于特定基因突变的引物必须用户单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计。
1. 共需设计两条完全互补的一对引物，它们覆盖要扩增的突变区位点，突变位点最好放在引物的中心。可以先集中设计一条，然后就可得互补的另一条引物。
2.引物的长度通常为25-45个碱基。引物中突变位点任何一侧都必需满足Tm大于45的条件，Tm 计算方式为Tm=4×(GC 碱基数)＋2×(AT 碱基数)。例如引物agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag 就达到此标准，它的突变位点AAG 所放位置使左侧Tm＝46；右侧Tm＝48，均大于45。
3. 尽量把引物的GC含量控制在40％-60％，结尾的1-3个碱基最好是G或C。
4. 尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。
5. 最好使用经过PAGE 纯化的引物或更高纯度的引物。

二、待突变模板质粒的选择
1. 必需使用从dam＋的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变，否则Dpn I 不能把没有酶切的质粒DNA 切除，产生大量的假阳性。常用的大部分大肠杆菌都是dam＋的，包括DH5α、JM109等。不能使用JM110和SCS110以及其它dcm-菌种。
2. 待突变质粒和目的基因的GC含量应该在40-55％，没有任何GC含量超过70%、长度在50bp以上的区域。如果质粒GC含量过高，请先把目的基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。如果目的基因GC含量过高，而突变位点不在高GC含量区域，可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果突变位点在高GC 区，则可以使用高GC 专用PCR反应试剂。

三、基因定点突变反应
1.在一个塑料离心管中加入下列成分：

待突变模板质粒	0.1-0.5μg
5×高保真酶Buffer	10μl
引物一(10-20 uM)	1μl
引物二(10-20 uM)	1μl
dNTP Mix(2.5mM each)	4μl
补水到	49μl

2. 加入1μl高保真DNA聚合酶，混匀，如果PCR仪没有热盖则需要加少量石蜡油。放入PCR仪器中按下面参数进行PCR：

步骤	温度	时间	循环数
变性	95℃	1min	1次
PCR	95℃	40s	18次
	60℃	1min
	68℃	1min/Kb
延伸	72℃	10min	1次
保存	4℃	长时间保持

四、Dpn I消化
PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1μL Dpn I内切酶(该酶在甘油保存液中会下沉到管底，故用前需要充分混匀)。DpnI可以酶切双链都被甲基化的模板质粒，也能降解一条链被甲基化的双链质粒。混匀后37℃孵育2小时后样品可以直接用于转化，或者-20℃保存备用。

五、转化、挑克隆鉴定：
每100 微升感受态细菌(转化效率必须在107/μg以上)中可以加入5-10微升经过Dpn I 消化后的突变产物，按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作。如果PCR 使用了石蜡油，在转化时千万别把它带入转化反应，否则会严重影响转化效率。
在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌全部涂布到含有适当抗生素的平板上培养过夜。通常会得到50个以下的克隆，可按常规方法制备质粒并测序。

六、常见问题：
1.转化后没有克隆或克隆数极少：
(1)感受态细菌效率不够高，请检测一下感受态细胞的效率，确保转化效率在107/μg。
(2)把Dpn I 消化后的产物用常规的乙醇沉淀浓缩，这样就可以把所有的产物全部用于转化。
(3)优化基因定点突变中的PCR参数。可以把最初的95℃变性时间延长为2分钟，循环中95℃变性的时间延长至1分钟，把循环中的68℃的延伸时间改为1.5分钟/kb 至2分钟/kb，退火可以改为60-55℃或65-55℃等的touch down，退火时间也可以适当延长。
(4)引物设计有问题。通过突变反应中的PCR 没有很好地扩增出预期的突变质粒。
2.有克隆，但没有或很难检测到预期的突变克隆：
使用的待突变的模板质粒量过多，导致Dpn I 消化时不完全，可减少质粒用量。
3. 有突变克隆，但突变位点不是预期的位点：
(1)引物设计不佳，退火温度过低，导致引物退火到错误的地方。
(2)引物质量较差，没有经过PAGE 纯化。这样引物中通常会含有比设计的引物要短的特异性较差的引物，容易导致非预期的突变。


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·动物线粒体纯化试剂盒A(粗提)
编号：BTN111207A
英文名称：Animal Mitochondria Purification Kit(A)
规格：5次
线粒体是非常重要的细胞器，它不但跟很多人类疾病相关，而且还是母系遗传研究的重要材料。对线粒体进行遗传研究和生化研究都需要纯化线粒体。本产品可用于纯化动物细胞线粒体的试剂盒。

产品特点：
1．即开即用，用户不需要自己配制各种溶液，优化各种条件。
2．有粗提和精提两个选择，但是精提需要超速离心机。粗提所得线粒体可以直接用于蛋白分析(SDS-PAGE、Western Blot、ELISA等)、蛋白组分析和线粒体DNA纯化。精提线粒体可以用于偶联分析和体外线粒体蛋白合成等实验。
3．本产品一次可以处理约2×108个培养细胞，30mg培养细胞(相当于15瓶150mm培养细胞)可以纯化到到0.5-1.5mg线粒体。
4．本产品适用于各种动物悬浮培养细胞和贴壁培养细胞，不能用于动物实体组织。
5．提供线粒体染液，可以在操作中随时监测纯化过程中线粒体的完整性。

试剂盒组成：

粗提型(BTN111207A)

成分	规格
溶液A	50ml
溶液B	250ml
蔗糖	80g
詹纳斯绿B染色液(0.2%)	1ml

精提型(BTN111207B)

成分	规格
溶液A	50ml
溶液B	250ml×2
蔗糖	100g
詹纳斯绿B染色液(0.2%)	1ml
说明书	1份

储存条件：常温运输和保存，保存期限一年。

使用方法：
注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或冷室进行，所要用到的溶液和离心管都必须预先冷却，否则线粒体容易破裂。

一、准备工作(此步骤同柱式动物线粒体DNA提取试剂盒中线粒体提取步骤)。未用完的下列溶液需要-20℃保存，否则容易长菌。下次使用前务必让沉淀溶解并摇晃均匀。
1．将溶液A和溶液B放冰上预冷待用。
2．配制1.7M高比重溶液(仅限BTN111207B精提型试剂盒，BTN111207A粗提型试剂盒不需要配制此溶液)：36克蔗糖用溶液B溶解并定溶到60mL，冰上预冷待用。
3．配制1.0M低比重溶液，BTN111207A粗提型试剂盒需要100mL，配制方法是将34克蔗糖用溶液B溶解并定溶到100mL，冰上预冷待用。111207B粗提型试剂盒需要150mL，配制方法是将51克蔗糖用溶液B溶解并定溶到150mL，冰上预冷待用。
4．配制线粒体重悬液，BTN111207A粗提型试剂盒需要200mL，配制方法是将150mL溶液B和50mL 1.0M低比重溶液混合；BTN111207B精提型试剂盒需要300mL，配制方法是将225mL溶液B和75mL 1.0M低比重溶液混合，即得300mL 线粒体重悬液，冰上预冷待用。

二、线粒体粗提(此步骤同柱式动物线粒体DNA提取试剂盒中线粒体提取步骤)
5．如果提取材料是单层细胞，先用60mL自备的PBS缓冲液洗涤2×108个培养的单层细胞，共洗涤2次。然后用塑料刮匙刮下细胞，重悬在60mL PBS缓冲液中。如果是悬浮细胞，则1000g 4℃离心10分钟收集2×108个细胞，再用60mL PBS缓冲液洗涤2次，最后将细胞重悬在60mL PBS缓冲液中。
6．用平甩转子(swinging-bucket rotor)离心机1000 g 4℃离心10分钟，吸弃上清，保留细胞沉淀。
7．加入5倍体积(以细胞沉淀的体积为基数)的预冷的溶液A，轻柔重悬细胞。
8．冰上放置4-5分钟。注意：冰浴时间不要超过5分钟。
9．如果是成纤维细胞，由于其难以裂解，可将细胞重悬液在-80℃放置20-30分钟后再化冻，然后进入下步操作。如果不是成纤维细胞，则直接进入下步操作。
10．将细胞重悬液体转移到预冷的Dounce玻璃匀浆器中(工作体积为10-15mL，间隙为0.12 mm，最好是玻璃材质，否则线粒体产率会降低)匀浆适当次数。细胞株不同，其最适匀浆次数不同，一般需要40次-60次左右。匀浆是线粒体纯化最关键的步骤，故匀浆前最好先通过预实验确定最适匀浆次数，方法是每匀浆5-10次后，取2-3μl匀浆液到载玻片上，然后在相差显微镜下观察，完整细胞数量降低到20%以下为佳。
11．加入1/3体积的、预冷的1.0 M低比重溶液，轻柔混匀。
12．用平甩转子离心机4℃ 1000 g离心10分钟。沉淀含残留完整细胞、细胞碎片和细胞核，上清液含线粒体。
13．转移上清液到离心管中，冰上放置。在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴50μL左右上清液到载玻片上，再滴入50μl詹纳斯染液绿B染色液20分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。
14．用固定角度转子(fixed-angle rotor)离心机4℃ 15000g离心15分钟，弃上清，所得棕黑色沉淀即为粗提线粒体沉淀。
15．用10mL线粒体重悬液重悬线粒体，4℃ 15000g离心15分钟，弃上清。
16．重复上步一次。
17．最后用适量的线粒体重悬液重悬线粒体，可用于各种后续实验(本试剂盒不提供相关试剂)，如果用于下面的精提操作，则用10mL线粒体重悬液重悬。

三、线粒体精提(需要超速离心机)
18．在跟超速离心机匹配的50mL的离心管中，加入10mL预冷的高比重溶液，再在上面加上10mL预冷的低比重溶液，最后再加上10mL线粒体粗提液。
19．70000g 4℃离心40分钟，线粒体将位于高比重溶液和低比重溶液之间区域。
20．小心用广口吸管吸出线粒体到新的离心管中，加入等体积的线粒体重悬液。
21．用平甩转子离心机1000 g 4℃离心10分钟，吸弃上清，保留线粒体沉淀。
22．用10mL线粒体重悬液重悬线粒体，在平甩转子离心机上4℃ 1000g离心10分钟，吸弃上清，保留线粒体沉淀。
23．再重复上步一次。
24．最后用适量线粒体重悬液重悬线粒体，得到线粒体精提液。可以直接用于Lowry法蛋白浓度测定，也可以用于其他后续实验。


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·T7核酸外切酶
编号：BTN130632
英文名称：T7 Exonulease
规格：1000U
本产品作用于双链DNA，沿 5´→3´方向催化去除 5´单核苷酸，它既能从5´末端起始消化，也能从双链DNA的切刻或缺口处起始消化。它既能降解 5´磷酸化 DNA 也能降解 5´去磷酸化DNA。据报道，它能沿 5´→3´方向降解RNA/DNA杂交双链上的RNA或DNA，但不能降解双链或单链RNA。该酶纯化自含TYB12内含肽融合子的E.coli菌株。

产品特点：
1．5´→3´核酸外切酶活性。
2．切下DNA的5´单核苷酸。

产品组成：

成分	规格
T7核酸外切酶(10U/μL)	1000U
10×反应Buffer	1ml
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

活性定义：1单位指在50μL反应体系中，25℃条件下，30分钟内能从双链DNA底物上催化产生1nmol的酸溶性脱氧核糖核苷酸所需要的酶量。

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