5´RACE试剂盒 基因结构和功能

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百奥莱博专业生产销*(代"售")5´RACE试剂盒 基因结构和功能，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：5´RACE试剂盒 基因结构和功能
品牌：百奥莱博
编号：BTN101105
规格：10次
产地：国产|进口
英文名：5´-RACE Kit
研究真核基因的最基础的工作之一就是确定其转录终止位点，目前最通用的方法是5´-RACE法，RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)是Frohman发明的、通过PCR快速克隆cDNA末端的技术，它在不建立cDNA文库的前提下，利用已知cDNA序列设计引物，通过往两端延伸和扩增获得其5´-端序列。本试剂盒就是根据5´-RACE原理而开发。RACE的原理如下图：


产品特点：
1. 即开即用，客户不需要单独准备各种材料。
2.反应条件经过精心优化，包括使用无RNase H活性的MMLV和优化的引物。

试剂盒组成：

 

成分	规格
MMLV逆转录酶-RI混合液(RNase H-，200U/μL)	10μl
MMLV Buffer-dNTP混合液	60μl
微量核酸沉淀剂	400μl
TdT(末端转移酶)	10μl
2×TdT Buffer(含dATP)	100μl
PCR MagicMix 3.0	1.5ml
5´-RACE引物A-引物B混合液	100μl
5´-RACE引物C	100μl
RNase-Free水	1ml

储存条件：低温运输、-20℃保存、有效期一年。

使用方法：

1.变性模板RNA：将1μg mRNA或5μg总RNA加入到一个RNase-free的PCR管中，补RNase-Free水到9μL，65℃保温5分钟后短暂离心，立即放冰上待用。如果RNA浓度偏低，体积超过9μl,可以使用本公司的核酸浓缩剂(需另购,产品编号为BTN110801)浓缩到所需的体积。
2. 设置RT反应(用户可以根据需要设阴性对照)：在上步的含变性后的RNA模板的PCR管中，按顺序加入：

成分	用量
自备的基因专一性引物A(10μM)	4μl
MMLV Buffer-dNTP混合液	6μl
MMLV逆转录酶-RI混合液	1μl
合计	20μl

3. 37℃保温60分钟，42℃保温30分钟，50℃保温10分钟，最后75℃保温10分钟使逆转录酶变性。
4. 短暂离心5秒后待用。
5.在PCR管中加入40μl微量核酸沉淀剂(本产品含不溶的核酸助沉剂，用前需要充分摇匀再取用)，震荡混匀。
6.室温12000rpm离心15分钟，小心吸弃上清。
7. 加入1mL自备75%乙醇，室温12000rpm离心5分钟，小心吸弃上清。
8. 短暂离心数秒，小心吸弃残留液体后，稍微晾干后加入10μL RNase-free水，充分吹打溶解，得到cDNA溶液。注意：为保证加尾效率，溶解cDNA的RNase-free水最好不要超过10μl。
9. 加尾反应：在10μL cDNA溶液中加10μL 2×TdT Buffer(含dATP)和1μL TdT酶，轻柔吹打混匀。
10. 37℃保温15分钟进行加尾反应，然后75℃保温3分钟灭活末端转移酶。
11. 加入0.5mL RNase-free水稀释加尾反应体系。此稀释液将作为PCR的模板。
12. 第一轮PCR：用不同量的稀释后的加尾反应液设置PCR反应(样品组最好设用量梯度，单位：μL)。

成分	梯度1	梯度2	梯度3	梯度4
PCR MagicMix 3.0	25	25	25	25
自备基因专一性引物B(10μM)	2.5	2.5	2.5	2.5
5´RACE引物 A-引物B混合液	2.5	2.5	2.5	2.5
稀释后的加尾反应液	1	5	10	15
RNase-free 水	19	15	10	5
合计	50	50	50	50

13. 按下列条件进行 PCR(注：应根据实际情况选择适当的退火温度)。
 第1次循环：94℃ 5分，48-52℃ 2分，72℃ 4分
 第2-30次循环：94℃ 40秒，52-60℃ 1分，72℃ 3分
 最后延伸：72℃ 15分
14. 取10-20μL PCR产物进行琼脂糖电泳电泳检查PCR结果，如果一条清晰的条带，则可以不做后续的第二轮PCR，而直接进行 DNA 测序或TA克隆。
15. 第二轮PCR：如果第一轮PCR没有一条清晰的条，则带从4管PCR产物中各取1μL分别加入到20μL RNase-free水中进行稀释，然后各取1μL分别作为4管第二轮PCR的模板：

成分	用量
第一轮 PCR产物的稀释液	1μl
PCR MagicMix 3.0	25μl
5´RACE引物 C	2.5μl
自备基因专一性引物 C(10μm)	2.5μl
RNase-free 水	补水至50μl
合计	50μl

16. 按下列条件进行 PCR：第 1-30次循环(94℃ 40秒，52-60℃ 1 分，72℃ 3分)，最后延伸：72℃ 15分
17. 取10-20μL第二轮 PCR产物进行琼脂糖电泳，一般都会有一个样品有清晰的条带出现，则可以直接进行DNA测序或TA克隆。

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5´RACE试剂盒 基因结构和功能关键词：5´-RACE Kit,BTN101105,5´RACE试剂盒

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·SSPE溶液，20×
编号：BTN100809
英文名称：Saline-Sodium Phosphate-EDTA
规格：250mL
20×的SSPE含3M NaCl、0.2M NaH2PO4、0.02M Na2EDTA，pH为7.4。它是一种在核酸分子杂交中广泛使用的溶液。其特点首先是盐浓度接近饱和，可以非常方便地稀释到不同浓度，提供不同的杂交和洗涤严谨度。其次，高盐浓度可以抑制微生物生长，便于长期放置。最后，它可以用于几乎所有核酸杂交试验。由于缓冲能力比SSC强，更适合于需要稳定pH的实验。

储存条件：常温运输及保存、有效期两年。

·HEPES溶液(1M,pH7.3)(DNA级)
编号：BTN140654
英文名称：Saline-Sodium Phosphate-EDTA
规格：250mL
20×的SSPE含3M NaCl、0.2M NaH2PO4、0.02M Na2EDTA，pH为7.4。它是一种在核酸分子杂交中广泛使用的溶液。其特点首先是盐浓度接近饱和，可以非常方便地稀释到不同浓度，提供不同的杂交和洗涤严谨度。其次，高盐浓度可以抑制微生物生长，便于长期放置。最后，它可以用于几乎所有核酸杂交试验。由于缓冲能力比SSC强，更适合于需要稳定pH的实验。

储存条件：常温运输及保存、有效期两年。

·环状DNA全基因组扩增试剂盒
编号：BTN100947
英文名称：Circular DNA Whole Genome Amplification Kit
规格：30次
本产品基于WGA的、专门用于环状DNA(如质粒)扩增的全基因组扩增试剂盒，优化后的反应体系对环状DNA全基因扩增有良好的效果，可以方便、简单、快速、经济的得到环状DNA样品的扩增产物。

产品特点：
1. 线状DNA清除剂可以清除残留的线状DNA，保留环状DNA，包括超螺旋DNA、带裂口(nick)的环状DNA和带缺口(gap)的环状DNA。
2. WGA采用基于phi29 DNA聚合酶的MDA法，能得到平均长度在10Kb以上的扩增产物，还具有高产量和高保真性的特点。
3.可以将环状DNA扩增上万倍，是保留珍贵痕量DNA样品的唯一办法。
4.可使用各种环状DNA样品，包括质粒DNA，环状病毒DNA，线粒体DNA等。
5. 操作简便快捷，恒温(30℃)反应，无须PCR仪即可实现扩增。
6.产物可用于多种后续试验，包括酶切、克隆、文库构建、测序、基因芯片分析等。

试剂盒组成：

成分	规格
线状DNA清除剂溶液A	100μl
线状DNA清除剂溶液B	30μl
WGA DNA变性液	75μl
WGA溶液A	150μl
WGA溶液B	300μl
Phi29 DNA聚合酶(10U/μL)	15μl
超纯水	1mL
说明书	1份

储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、去除环状样品中的线状DNA(线状DNA量不超过5μg)
1.在干净塑料离心管中，按下表加入各成分(30μL体系)：

成分	样品	正对照	负对照
自备DNA样品(1-10μg)	(样品)	(用环状DNA)	(用线状DNA)
线状DNA清除剂溶液A	3μL	3μL	3μL
线状DNA清除剂溶液B	1μL	1μL	1μL
	补水到30μl	补水到30μl	补水到30μl

2. 加200μL石蜡油后，37℃保温16小时。注意：保温时间过短可能会形成短的DNA片段，影响后续反应，所以最好保温16小时。必须加石蜡油，否则长时间保温期间水分会蒸发到管盖上。如果使用热盖打开的PCR仪则可以不加石蜡油。
3. 65℃加热灭活线状DNA清除反应的酶。
4.电泳检测酶切效果。本产品不清除带裂口(nick)和带缺口(gap)的环状DNA(如质粒)，所以这些片段将不会消失。如果所含线状DNA超过5μg，则需要用非酶线性DNA清除剂清除或者稀释后用本法处理。
5. WGA扩增需要100pg-100ng的环状DNA，一般环状DNA的浓度都高于此范围，则需用超纯水将DNA稀释到40pg-40ng/μL，稀释过程中线状DNA清除反应中的成分也相应稀释，故一般不会影响后续WGA反应。如果样品中DNA浓度过低，则需要用微量核酸沉淀剂(需另买)沉淀后再溶解到适当体积的超纯水中，沉淀过程中线状DNA清除反应中的成分也被去除。

二、碱变性(对环状DNA，碱变性法一般优于热变性法，推荐用户使用)
6.在PCR塑料管中加入不超过2.5μL环状DNA样品。如果体积不足2.5μL，则用超纯水补齐。最好同时做一个不加样品的阴性对照。
7. 加入等体积(2.5μL)WGA DNA变性液，轻柔吹打混匀。
8.室温放置2分钟变性。
9. 加入5μl WGA溶液A，轻柔吹打混匀后立即进入第15步。注意：热变性的DNA样品不能久存，否则DNA会缓慢复性，所以必须马上进入后续处理。

三、热变性法
10.在PCR塑料管中加入1-5μL纯化好的环状DNA，用量在100pg-100ng之间。最好同时做一个不加DNA模板的阴性对照。
11. 加入5μL WGA溶液A，轻柔吹打混匀。
12. 如果不足10μL，补水到10μL。
13.在PCR仪器上 95℃加热变性3～5分钟，其间最好打开PCR仪的热盖。也可以使用95℃水浴加热3分钟。
14. 热变性结束后短暂离心(将蒸发到管壁的水甩下)，然后将样品管在冰上放置至少5分钟，立即进入第15步。注意：热变性的DNA样品不能久存，否则DNA会缓慢复性，所以必须马上进入后续处理。

四、WGA反应
15.在10μL碱变性或热变性的DNA样品中，加入10μL的WGA溶液B，轻柔吹打混合均匀。
16. 加入0.5μL Phi 29 DNA聚合酶(10U/μL)，轻柔吹打混合均匀。
17. 30℃保温3-12小时。最好使用PCR仪进行30℃保温并打开热盖保温。如果采用30℃水浴，最好在样品管中加入50μL石蜡油以防水分蒸发，因为30℃长时间的水浴也能使水分蒸发到管壁，从而改变反应体系中各成分的浓度、降低WGA反应效率。如果模板DNA量比较高，WGA三小时即可检测到DNA扩增。
18. 65℃保温10分钟使phi29 DNA聚合酶灭活。注：由于phi29 DNA聚合酶有DNA外切活性，所以最好将其灭活以免干扰后续反应。
19. 立即取2-5μL WGA反应液进行电泳检测扩增效果。
20.扩增的DNA可以用于后续试验或放冰箱长期保存。

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