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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件:
室温(15~30℃)
- 保质期:
长期
- 英文名:
SuperPure RNA Extraction Kit(DNase I)
- 库存:
736
- 供应商:
北京百奥莱博科技有限公司
特别声明:本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品,严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。
北京百奥莱博专注于生命科学和生物技术领域,致力于为客户提供包括北京现货超纯RNA提取试剂盒(DNase I)销*(代"售")在内的一系列分子生物学试剂产品,并提供一系列相关的技术服务。
名称:北京现货超纯RNA提取试剂盒(DNase I)销*(代"售")
品牌:百奥莱博
规格:50次
编号:WE0193
英文名:SuperPure RNA Extraction Kit(DNase I)
产地:国产|进口
本试剂盒是基于TRIzon改进后的柱式总RNA提取试剂盒,本制品可以从动物组织、植物材料、各种微生物及培养细胞等样品中提取总RNA。首先裂解液充分裂解并匀质化样本,在特有的高盐状态下,RNA特异性地与硅基质结合,在极大程度减少了蛋白污染的同时有效去除了有机溶剂的污染,得到的RNA纯度更好,质量更高。本产品可从各细胞或组织中快速提取总RNA,每次可处理 30-50 mg组织或 5×106 细胞,可同时处理多个不同样品。如果是对微量DN非常敏感的RNA实验,残留的DNA可利用无RNase的DNase在柱上进行消化去除,提取后的RNA可直接应用于RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、体外翻译等实验。
试剂盒组成:
| 组份 | 50次 |
| DNase I | 1000 U |
| 10×Reaction Buffer | 1000μl |
| TRIzon Reagent | 60ml |
| Buffer RW1 | 40ml |
| Buffer RW2(浓缩液) | 11ml |
| RNase-Free Water | 10ml |
| 吸附柱RM及收集管 | 50套 |
| RNase-Free离心管(1.5ml) | 50个 |
保存条件:DNase I及10×Reaction Buffer -20℃保存,TRIzon Reagent 2~8℃避光保存,其它组分室温(15~30℃)。
自备试剂:*仿(新开封或提取RNA专用)、70%乙醇(无RNase水配制)、无水乙醇。
实验前准备及重要注意事项/strong>:
1、预防RNase污染,应注意以下几方面:
1)使用无RNase的塑料制品和枪头,避免交叉污染。
2)配制溶液应使用无RNase的水。
3)操作人员戴一次性口罩和手套,实验过程中要勤换手套。
2、样品应避免反复冻融,否则影响RNA提取得率和质量。
3、使用前若发现TRIzon Reagent有沉淀,可置于56℃水浴几分钟,即可溶解。
4、第一次使用前应按照试剂瓶标签说明在Buffer RW2中加入无水乙醇。
5、所有离心步骤若无特殊说明均在室温下进行,且所有操作步骤动作要迅速。
操作步骤:
1、样品处理
① 组织:30-50 mg组织在液氮中充分研磨后加入1ml TRIzon Reagent,或在组织样品中加入1ml TRIzon Reagent后匀浆处理。
注意:样品体积不超过TRIzon Reagent体积的10%。
② 单层培养细胞:吸去培养液,加入适量 ,每10cm2加入1ml TRIzon Reagent。
③ 细胞悬液:离心收集细胞。每5×106细胞加入1ml TRIzon Reagent。
2、样品中加入TRIzon Reagent后反复吹打几次,使样本充分裂解。室温放置5分钟,使蛋白核酸复合物完全分离。
3、以每1ml TRIzon Reagent加入200μl*仿的比例加入*仿,盖好管盖,剧烈振荡15秒,室温放置2分钟。
4、4℃ 12000rpm(~~13400×g)离心10分钟,此时样品分为三层:红色有机相,中间层和上层无色水相,RNA主要在上层水相中,将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管(自备)中。
5、在得到的水相溶液中加入等体积的70%乙醇(无RNase水配制),颠倒混匀。
6、将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中。若一次不能加完溶液,可分多次转入。12000rpm离心20秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
7、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1,12000rpm离心20秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
8、配制DNase I 混合液:取52μl RNase-Free Water,向其中加入8μl 10×Reaction Buffer和20μl DNase I(1 U/μl),混匀, 配制成终体积为80μl的反应液。
9、向吸附柱中直接加入80μl DNase I 混合液,20-30℃孵育15分钟。
10、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1,12000rpm离心1分钟,弃废液,将吸附柱重新放回收集管中。
11、向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心20秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
12、重复步骤11。
13、12000rpm离心2 分钟,倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟,彻底晾干。
注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR 等)。
14、将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中,向吸附柱的中间部位加入30-50μl RNase-Free Water,室温放置1分钟,12000rpm离心1分钟,收集RNA溶液,-70℃保存RNA,防止降解。
注意:
1)RNase-Free Wate体积不应小于30μl,体积过小影响回收率。
2)如果要提高RNA的产量,可用30-50μl新的RNase-Free Water重复步骤14。
3)如果要提高RNA浓度,可将得到的溶液重新加入到吸附柱中,重复步骤14。
储存条件:室温(15~30℃)。
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北京现货超纯RNA提取试剂盒(DNase I)销*(代"售")关键词:DNase I,超纯RNA提取试剂盒,SuperPure RNA Extraction Kit(DNase I),WE0193,超纯RNA提取试剂盒(DNase I)
·一步法Real-Time RT-qPCR试剂盒
编号:WE0137
英文名称:SuperSYBR One Step RT-qPCR Kit
规格:100次
本试剂盒是一步法Real-Time RT-qPCR专用试剂盒。所含的SYBR Green I荧光染料可以与所有的双链DNA相结合,使该产品可以用于多种不同靶序列的检测而不需合成特异性标记探针。使用本产品进行Real Time RT-qPCR反应,逆转录和定量PCR在同一反应体系中进行,反应过程中无需添加试剂,无需打开管盖,避免了污染的同时提高了实验效率。全新高效逆转录酶RNase H活性缺失,减少了逆转录反应中RNA的降解。该酶逆转录效率高,可对少量 RNA模板进行良好的逆转录反应。与RNA亲合性高,能通读GC含量高,二级结构复杂的RNA模板。全新高效热启动酶,在常温下酶的活性被封闭,从而有效避免在常温条件下由引物和模板非特异性结合或引物二聚体而产生的非特异性扩增,极大提高了荧光定量PCR反应的精确性。所包含的缓冲系统使以上两种酶同时发挥最大功效,提高效率。本产品灵敏度高,特异性高,线性范围广,对目的基因定量更准确。
ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差,一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR 扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同,因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
不需要ROX校正的仪器:(WE0137)
Roche LightCycler 480,Roche LightCyler 96,Bio-rad iCyler iQ,iQ5,CFX96等。
需要Low ROX校正的仪器:(WE0138)
ABI Prism7500/7500 Fast,QuantStudio® 3 System,QuantStudio® 5 System,QuantStudio® 6 Flex System,QuantStudio® 7 Flex System,ViiA 7 system,Stratagene Mx3000/Mx3005P,Corbett Rotor Gene 3000等。
需要High ROX校正的仪器:(WE0139)
ABI Prism7000/7300/7700/7900,Eppendorf,ABI Step One/Step One Plus等。
试剂盒组成:
| 组份 | WE0137-100次 | WE0138-100次 | WE0139-100次 |
| 2×SuperSYBR One Step Buffer | 1.4ml | 1.4ml | 1.4ml |
| SuperSYBR One Step EnzymeMix | 50μl | 50μl | 50μl |
| 50×Low ROX | - | 50μl | - |
| 50×High ROX | - | - | 50μl |
| RNase-Free Water | 1.5ml | 1.5ml | 1.5ml |
注意事项:
1、本试剂盒中的各试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀,尽量避免起泡,并经短暂离心后使用。
2、本产品以RNA为模板进行一步法RT-PCR实验,在操作过程中应避免RNase污染,建议在专门的区域进行RNA操作,使用专门的仪器和耗材,操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套,实验相关耗材应用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时,并高压灭菌30分钟后使用。
3、SuperSYBR One Step RT-qPCR Buffer中含有SYBR Green I 荧光染料,保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
4、本试剂盒中的各试剂应避免反复冻融,反复冻融可能使产品性能下降。本产品长期保存可置于-20℃,避光。如果在短期内需要频繁使用,可在2~8℃保存。
5、本试剂盒必须使用特异性引物,引物的选择可根据具体实验来选择,引物设计的好坏直接影响到RT-PCR反应的结果,设计引物时需考虑GC含量,引物长度,引物位置,PCR产物的二级结构等因素,建议采用专业的引物设计软件进行设计。
6、本品不能用于探针法荧光定量PCR。
操作步骤:
1、将RNA模板、引物、2×SuperSYBR One Step Buffer、SuperSYBR One Step EnzymeMix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2、PCR反应体系
| 试剂 | 25μl反应体系 | 终浓度 |
| 2×SuperSYBR One Step Buffer | 12.5μl | 1× |
| Forward Primer,10μM | 0.5μl | 0.2μM |
| Reverse Primer,10μM | 0.5μl | 0.2μM |
| SuperSYBR One Step EnzymeMix | 0.5μl | |
| RNA Template | Xμl | 10 pg~100ng |
| 50×Low ROX or High ROX(optional) | 0.5μl | 1× |
| RNase-Free Water | up to 25μl |
注意:
1)通常引物浓度以0.2μM可以得到较好结果,可以终浓度0.1-0.5μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下,可提高引物的浓度;发生非特异性反应时,可降低引物浓度,由此优化反应体系。
2)不同仪器的激发光学系统有所不同,根据使用荧光定量的仪器选择加入50×Low ROX or 50×High ROX。
3、涡旋震荡混匀,短暂离心,将溶液收集到管底。
4、RT-qPCR反应条件(荧光定量PCR为两步法),本程序是以ABI 7500荧光定量PCR仪为例。
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 反转录 | 45℃ | 10 min | |
| PCR预变性 | 95℃ | 5 min | |
| 变性 | 95℃ | 10 s | 30-40个循环 |
| 退火/延伸 | 60℃ | 45 s | |
| 融解曲线分析 | 95℃ | 15 s | |
| 60℃ | 1 min | ||
| 95℃ | 15 s | ||
| 60℃ | 15 s |
注意:
1)建议采用两步法PCR反应程序,若提高反应特异性,可提高退火温度,以60-64℃作为设定范围的参考;若因使用Tm值较低的引物等原因,得不到良好的实验结果时,可尝试进行三步法PCR扩增。
2)融解曲线分析请以所使用的荧光定量PCR仪推荐的程序进行设定,本程序是以ABI7500荧光定量PCR仪为参照设定。
RT-qPCR反应条件(荧光定量PCR为三步法):
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 反转录 | 45℃ | 10min | |
| PCR预变性 | 95℃ | 5min | |
| 变性 | 95℃ | 15s | 30-40 个循环 |
| 退火 | 56℃-64℃ | 30s | |
| 延伸 | 72℃ | 30s | |
| 融解曲线分析 | 95℃ | 15s | |
| 60℃ | 1min | ||
| 95℃ | 15s | ||
| 60℃ | 15s |
注意:
1)三步法PCR扩增时,退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考。
2)融解曲线分析请以所使用的荧光定量PCR仪推荐的程序进行设定,本程序是以ABI 7500荧光定量PCR仪为参照设定。
储存条件:-20℃,避免反复冻融
北京现货超纯RNA提取试剂盒(DNase I)销*(代"售")关键词:DNase I,超纯RNA提取试剂盒,SuperPure RNA Extraction Kit(DNase I),WE0193,超纯RNA提取试剂盒(DNase I)
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