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pBApo-EF1α-neo
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钰博生物
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pBApo-EF1α-Neo DNA是一种简单的应用于哺乳动物细胞的基因表达载体。该载体具有人多肽链延伸因子基因来源的启动子 (EF1α promoter)、单纯疱疹病毒胸苷激酶来源的polyA信号、新霉素抗性基因。通过在MCS区域插入目的基因的开放阅读框 (ORF),构建目的基因表达载体。除了通常的基因以外该载体可以用于pri-microRNA的转录。此外,还可以很容易地将 (promoter+ORF+PolyA signal) 从这个载体上转移到腺病毒载体上,尤其是转移到Adenovirus Dual Expression Kit (Code No.: 6170) 的组分pAxcwit上。腺病毒载体感染效率高,范围广,可以用于体外和体内的基因转导。使用方法1. 插入基因在质粒载体的克隆位点处插入目的基因的开放阅读框(ORF)。因为载体上有氨苄青霉素抗性基因,可以从大肠杆菌中筛选重组体。2. 转染使用 TransIT 系列、Xfect 系列(Clontech)等转染试剂将质粒导入细胞内。转染条件请参考转染试剂的实验流程。3. 转染细胞的筛选pBApo-EF1αNeo DNA 具有新霉素抗性基因、pBApo-EF1αPur DNA 具有嘌呤霉素抗性基因,可以利用抗生素筛选转染细胞。在质粒转染后培养 24 小时以上,开始使用抗生素筛选。在细胞密度较高的情况下,可以适当地稀释细胞后重新培养。每 3~4 天更换含抗生素的培养基。通常 1~2 周可以获得转染细胞的克隆。由于不同细胞对抗生素的耐药性不同,需要研讨适合的抗生素浓度。通常 NeoR(新霉素)浓度为 500~1,000 μg/ml,PurR(嘌呤霉素)浓度为 1~3 μg/ml。4. 置换表达框(unit)pBApo-EF1α系列载体经过 Cla I 或 EcoR V 酶切,将表达框(unit)(EF1a promoter+插入基因+PolyA signal)从质粒中切出,可以轻易地转移至其他载体上。特别是 Adenovirus Dual Expression Kit(CodeNo. 6170),该载体多克隆位点上有 Cla I 和 Smi I 酶切位点,可以很轻易地将表达框转移至腺病毒载体上。(EcoR V 和 Smi I 都产生是平滑末端,适合片段与腺病毒载体连接)
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