北京现货基因定点突变试剂盒品牌

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名称：北京现货基因定点突变试剂盒品牌
规格：10次
编号：YT027
英文名：Site-directed Gene Mutagenesis Kit
产地：国产|进口
本试剂盒可以用于点突变，多个邻近密码子的突变，单个或多个邻近密码子的缺失(deletion)或插入(insertion)。

本试剂盒是一个利用目前最新的基因点突变技术设计而成的试剂盒。只需通过基于PCR的突变质粒的合成，和基于Dpn I的模板质粒的消化，转化培养以及后续的酶切或测序鉴定，即可得到预期的突变质粒(参考图1)。累计操作时间不足2小时即可完成基因的定点突变。



参考上图，使用本试剂盒时需要先设计长度通常为30个碱基以上的互补的两个引物，在引物中含有预期的突变位点。然后以待突变的质粒为模板，用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变位点的双链质粒，但这个双链质粒中有两个nick位点。待突变的质粒通常来源于大肠杆菌等细菌，在细菌中会被甲基化修饰，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用甲基化酶Dpn I处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。这样把Dpn I处理过的产物转化细菌后，质粒中有两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。

本试剂盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受态细菌的制备。

试剂盒组份：

Pfu DNA Polymerase	10μl
Reaction Buffer(10X)	100μl
dNTP Mix(2.5mM each)	50μl
Dpn I	10μl
DH5α 甘油菌	200μl
Nuclease-Free Water	1ml

储存条件：-20℃，有效期一年。

使用说明：

1. 引物设计：
用于特定基因突变的引物需要单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计：
(1) 共需设计两条互补的引物。可以先集中设计一条，然后就可以得到互补的另一条引物。
(2) 引物的长度通常为25-45个碱基。
(3) 引物中突变位点任何一侧都必需满足 4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数) ≥45。但引物也不宜过长，否则通常会形成非常稳定的二级结构。通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右，且使两侧按照上述计算得到的数值相近。
例如引物为agtcaggccaattcgaagcagtcgaattgccaag，其中蓝色的aag为突变位点，则
左侧：4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)＝4X8＋2X7＝46≥45
右侧：4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)＝4X8＋2X8＝48≥45
(4) 在可能的情况下，尽量把引物的GC含量控制在40％-60％。
(5) 在可能的情况下，尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。二级结构和二聚体可以通过一些软件进行分析。
(6) 最好使用经过PAGE纯化的引物或更高纯度的引物。

2. 引物的配制：
如果合成得到的一个引物A的量是20nmol，另外一个互补引物B的量是19nmol。在引物A中加入200微升水，配制成浓度为100µM，在引物B中加入190微升水也配制成浓度为100µM。吸取20微升100µM引物A和20微升100µM引物B到一新的离心管中，再加入160微升水，混匀后即可得到可以直接用于基因定点突变反应的引物(10µM each)。

3. 待突变模板质粒的选择：
选择GC含量在40-55％的待突变模板质粒，并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果GC含量过高，请先把目的基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。另外目的基因GC含量最好也在40-55％的范围，并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果目的基因GC含量过高，而突变位点不在高GC含量区域，可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的质粒模板，或者有局部高GC含量的质粒模板，请另外使用专门用于高GC含量模板的PCR反应试剂。
必需使用从dam＋的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变。常用的大部分大肠杆菌都是dam＋的，包括DH5α、JM109等。

4. 基因定点突变反应：
(1) 如下设置基因定点突变反应体系：
Nuclease-Free Water———>?µl
Reaction Buffer (10X)——>5µl
引物 (10µM each)————>2µl
dNTP Mix (2.5mM each)——>4µl
待突变模板质粒(0.5µg)——>?µl
总体积——————————>49µl
按照上面的顺序依次加入各种试剂。在上述反应体系中，根据待突变模板质粒的量，计算出需加入的Nuclease-Free Water的量，使总体积为49微升。适当混匀后，加入 1 ul Pfu DNA Polymerase，混匀。如果用的PCR仪没有热盖，在反应体系上加入一滴矿物油(mineral oil)以防止蒸发。
(2) 按照如下参数设置PCR仪：

步骤	循环数	温度	时间	说明
1	1	95℃	1分钟	最初变性
2	18	95℃	40秒	变性
		60℃	1分钟	退火
		68℃	1分钟/kb	延伸
3	1	72℃	10分钟	延伸、补全
4	1	4℃	长时间保持	暂时存放

说明：上面表格中1分钟/kb表示，如果待突变的质粒为6kb，那么68℃的延伸时间为6分钟。

5. Dpn I消化：
PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1微升Dpn I，混匀后37℃孵育1小时。37℃孵育可以在PCR仪上进行，也可以在水浴锅中进行。Dpn I消化完毕后可以直接用于转化，或者-20℃保存备用。

6. 转化、挑克隆鉴定：
感受态细菌的转化效率必需至少在107以上，否则很难得到克隆。根据所使用的感受态细菌，加入尽量多的经过Dpn I消化后的突变产物用于转化。通常每100微升感受态细菌中可以加入5-10微升经过Dpn I消化后的突变产物。按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作，在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌，全部涂布到含有适当抗生素的平板上，培养过夜。通常会得到50个以下的克隆。如果发现克隆有上千个，那么肯定是有什么地方出了问题。
对于得到的克隆，可以先挑克隆小抽酶切鉴定。以确认得到的质粒的大小和质粒中插入片断的大小与预期结果是否相符。
取3-5个酶切鉴定正确的克隆去测序，以最终确认得到的克隆是否是预期的突变克隆。通常大约每2个克隆中会得到一个预期的突变克隆。但有时也可能会因为随机因素，会测序了3-5个克隆才得到一个预期的突变克隆。

更多有关北京现货基因定点突变试剂盒品牌的价格及使用说明等，请联系我们的业务经理王欣女士咨询，我公司还销*(代"售")以下产品：

·HDAC1抗体
编号：YT790
英文名称：anti-HDAC1 antibody
规格：>20次
本抗体是用表达纯化的小鼠HDAC1 aa53-482一段多肽进行适当修饰后免疫rabbit，然后用protein A和抗原多肽亲和柱经过两步纯化得到的高纯度抗体。本抗体如果用于常规的Western检测，至少可以检测20次。

本HDAC1抗体识别的是总HDAC1(total HDAC1)，可以检测内源性的HDAC1，未发现和其它HDAC蛋白有交叉反应。

染色质由重复的核小体(necliosome)构成，而核小体则包含了由Histone H2A，H2B，H3和H4各两个分子组成的八聚体和与该八聚体结合的DNA。组蛋白(histone)上的一些Lys位点，可以被乙酰化修饰，从而影响染色质的空间结构，最终影响该区域的基因转录调控。通常当组蛋白被乙酰化时，染色质处于相对松散的构象，此时转录因子可以结合到该区域促进相关基因的转录。反之，当组蛋白被去乙酰化时，染色质结构会变得相对致密，该区域相关基因的转录就会被抑制。组蛋白可以被多种乙酰化酶乙酰化，包括PCAF，p300/CBP，GCN5，SRC-1，TAFII250，BRCA-2和Patt1等。组蛋白去乙酰化酶包括HDAC(histone deacetylase)家族和Sirtuin家族(Sirt家族)。HDAC家族包括HDAC1，HDAC2，HDAC3，HDAC4，HDAC5，HDAC6，HDAC7，HDAC8，HDAC9，HDAC10和HDAC11。通常HDAC可以去乙酰化染色质中某些特定区域的组蛋白，导致该区域的染色质结构变得相对紧密，从而抑制该区域相关基因的表达。Class I HDAC包括HDAC1，2，3，8；Class II HDAC包括HDAC4，5，6，7，9，10。Sirtuin家族被称为Class III HDAC。Class IV HDAC只包括HDAC11。HDAC1，2，8主要定位在细胞核；而HDAC3则在细胞核和细胞浆都有分布，并且分布在膜结构上。Class II HDAC在特定条件下可以在细胞核和细胞浆之间穿梭(shuttle in and out)。HDAC在命名时被称为组蛋白去乙酰化酶，但事实上它们可以去乙酰化多种多样的蛋白。例如，HDAC6可以和微管(microtuble)结合，可以去乙酰化tubulin，Hsp90和cortactin等。目前发现大量的蛋白可以被乙酰化修饰，因此HDAC等乙酰化修饰酶被认为在基因转录调控、信号转导、生长发育、分化凋亡、代谢性疾病和肿瘤等多种生理病理过程中发挥重要作用。HDAC的抑制剂目前被认为是很有前景的肿瘤治疗药物。

产品组份：
HDAC1抗体————40μl
Western一抗稀释液————20ml

抗体参数：

免疫原物种：小鼠
免疫原：表达纯化的小鼠HDAC1 aa53-482一段多肽
宿主：兔
用途：WB,IP,IC
交叉反应性：人，小鼠，大鼠
同种型：IgG
HDAC1分子量：～65kD
推荐稀释比例：WB(1:500),IP(1:50),IC(1:100)

注意事项：
1. 在Western实验后，请注意回收稀释的抗体。回收的抗体在进行Western实验时至少可以重复使用10次。稀释后的抗体，包括已经使用过的稀释抗体，4℃保存。
2. 回收后重复使用的抗体，使用方法同新鲜稀释的抗体。如果在重复使用过程中发现抗体出现轻微混浊现象，可以10000g离心1-3分钟，取上清用于后续检测。如果回收的抗体出现明显的絮状物或长霉长菌等情况，则可以考虑废弃该抗体。


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·Alexa Fluor 350抗兔免疫荧光染色试剂盒
编号：YT102
英文名称：Immunol Fluorence Staining Kit with Alexa Fluor 350-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG
规格：>300次
本试剂盒含有Alexa Fluor 350标记的山羊抗兔IgG(H+L)抗体，可以用于检测兔来源的相应一抗，观察到的颜色为非常鲜艳的蓝色。Alexa Fluor 350的荧光光谱与DAPI和Hoechst比较接近。Alexa Fluor 350的吸收峰346nm、发射峰442nm。本试剂盒提供了含有荧光标记抗体稳定剂的免疫荧光染色二抗稀释液，可以确保荧光标记抗体稀释后在4℃可以保存长达6个月，并且在6个月内至少可以重复使用10次。本试剂盒含有抗荧光淬灭封片液，可以使荧光更加持久。本试剂盒对于六孔板内的细胞样品或常规切片，至少可以检测300个样品。

试剂盒组份：
抗兔Alexa Fluor 350————————————0.03ml
免疫荧光染色二抗稀释液—————50ml
抗荧光淬灭封片液————————15ml

注意事项：
1. 需荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。
2. 在使用抗荧光淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭，但仍宜尽量避光，特别是需要尽量缩短在荧光显微镜下的观察时间。
3. 荧光物质均易发生淬灭，染色后宜尽快进行荧光显微镜下的观察。如果不能及时观察可以4℃避光保存，但存放时间通常不宜超过一周，随着存放时间的延长可能会导致观察效果越来越差。
4. 免疫荧光染色效果的好坏和一抗的关系非常密切。建议选购有较多文献报道的并注明可以用于免疫荧光染色的一抗用于本实验。
5. 如果观察时发现荧光过弱，可以适当提高一抗的浓度；如果荧光还是比较弱，可以适当提高荧光标记抗体的浓度。

储存条件：-20℃，有效期一年。


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PY01-128  果胶  250克  
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4-甲氧基*乙酮 2,2"-Biphenol 100-06-1
PY01-101  乳酸*  100克  
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