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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件:
避免反复冻融。2-8°C不超过一个月,-80°C不超过12个月
- 保质期:
1年
- 英文名:
Recombinant Cytochrome P450 21B (CYP21B)
- 库存:
30
- 供应商:
联迈生物
- 规格:
10µg/50µg/200µg/1mg/1g
| 来源 | 原核表达 |
| 宿主 | E.coli |
| 内毒素水平 | <1.0EU/µg(LAL法测定) |
| 亚细胞定位 | n/a |
| 片段与标签 | N-terminal His Tag |
| 缓冲液成份 | 磷酸盐缓冲液(pH7.4,含有 0.01% SKL, 1mM DTT, 5% Trehalose和Proclin300.) |
| 性状 | 冻干粉 |
原理:
蛋白质的翻译效率很大程度上跟翻译起始效率有关,因此mRNA的5'端必须得很好翻译,最好不要有复杂的二级结构;通过PCR的方法在基因的5‘端引入简并序列,构建克隆,挑选多个克隆,诱导表达之,SDS-PAGE电泳检测表达量的高低,挑选高表达克隆进行测序。
实验步骤:
1.设计目的重组蛋白质的N端10-15个氨基酸的简并序列。
2.引物合成上述简并序列,同时设计合成目的基因反向引物。
3.PCR扩展目的基因,这样在目的基因的5‘端就引入了兼并序列,同时不改变氨基酸序列。
4.双酶切,插入到目标载体。
5.转化。
6.挑选多个克隆(比如100-200个)到1.5ml EP管,直接诱导表达(记得带上为改造克隆菌株的对照)。
7.SDS-PAGE检测。
8.挑选高表达的多个克隆,测序。
重组蛋白的特性
Immune tech的重组蛋白分为冻干粉和溶液态两种保存形式,原核细胞表达的重组蛋白为冻干粉状态,真核细胞表达的重组蛋白为溶液态保存,这样使得重组蛋白非常稳定,在-80℃条件下可保存数年。冻干粉在使用前需进行溶解,其中溶解的方法非常关键,因为溶解不好会降低蛋白的效用。溶液态保存的重组蛋白在冻融稀释使用过程中也需要仔细注意,这些都是用户在实际应用中经常遇到的问题。
(1)原核细胞表达的重组蛋白。Immune tech大肠杆菌表达的冻干重组蛋白,已经从包涵体中提纯,添加了蛋白保护剂,使用过滤后的无菌水作为复溶剂即可,复溶冻干蛋白100 μg,用86 μl的超纯水,轻轻摇晃使蛋白溶解,再用移液枪的枪头轻吹几下即可完全溶解,一定不能使用涡旋仪进行快速振荡或剧烈摇晃。
(2)真核细胞表达的重组蛋白。有活性的蛋白质不仅要转录和翻译,还要进行翻译后的加工,使得蛋白质的空间折叠方式维持正常,所以重组蛋白必须在真核细胞中进行,如哺乳动物细胞能够识别和去除基因中的内含子,对翻译后的蛋白质进行加工,这样表达的蛋白质具有生物活性。我们用溶液态来保存,保持了其良好的活性和稳定性。
(3)重组蛋白的保护剂。在冻干和储存过程中常用的保护剂或稳定剂有糖类,多元醇,聚合物,表面活性剂,某些蛋白和氨基酸等。我们通常加8%(质量比体积)的海藻糖和甘露醇作为冻干保护剂。海藻糖可明显阻止蛋白质二级结构改变以及冻干过程中蛋白质的伸展和聚集,甘露醇也是一种普遍应用的冻干保护剂和填充剂。
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文献和实验细胞色素P450(cytochromeP450或CYP450,简称CYP450)为一类亚铁血红素—硫醇盐蛋白的超家族,它参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢。 细胞中,细胞色素P450主要分布在内质网和线粒体内膜上,作为一种末端加氧酶,参与了生物体内的甾醇类激素合成等过程。近年来,对细胞色素P450的结构、功能特别是对其在药物代谢中的作用的研究有了较大的进展。最新研究表明细胞色素P450还是药物代谢过程中的关键酶,而且对细胞因子和体温调节都有重要
Cell Rep Med:中山大学项鹏 / 邓春华团队联合开发基因疗法恢复小鼠睾酮分泌与生育能力
症、细胞色素 P450 氧化还原酶(POR)缺乏症、17α-羟化酶(CYP17A1)缺乏症、17β-羟基类固醇脱氢酶 3 型(17β-HSD3)缺乏症等。此研究为 LCF 的治疗提供了新的思路,并有望以个性化的方式应用到 70 多种遗传性性腺功能衰竭等疾病的治疗中。 综上所述,本研究证实了 AAV 介导的基因治疗遗传性 LCF 的可行性、安全性和有效性,为遗传性 LCF 基因药物的研发奠定了重要基础。 中山大学中山医学院项鹏教授和中山大学附属第一医院邓春华教授为共同通讯作者,团队成员夏凯、汪富林
是异染色质的siRNA 介导的组蛋白H3 K9 的甲基化,是由H3 甲基转移酶催化的 。 ②转录后水平。⑴特异切割dsRNA 的RNA 酶Ⅲ家族核酸酶Dicer 依赖ATP 切割dsRNA ,将其分解成具有2 个核苷酸的3′悬端(overhang) 的19~21b 小片段的双链siRNA。⑵RISC(RNA 诱导的沉默复合物RNA-induced silence complex) 识别并降解mRNA。RISC 是一种蛋白-RNA 效应器核酸酶复合物。双链siRNA
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