- ￥1980 - 4280
- LMAI Bio
- 美国/中国
- LM072Ra01
- 2025年07月08日
企业认证
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
避免反复冻融。2-8°C不超过一个月，-80°C不超过12个月
- 保质期：
1年
- 英文名：
Recombinant Carbonic Anhydrase VB, Mitochondrial (CA5B)
- 库存：
30
- 供应商：
联迈生物
- 规格：
10µg/50µg/200µg/1mg/1g
| 来源 | 原核表达 |
| 宿主 | E.coli |
| 内毒素水平 | <1.0EU/µg(LAL法测定) |
| 亚细胞定位 | n/a |
| 片段与标签 | N-terminal His Tag |
| 缓冲液成份 | 磷酸盐缓冲液（pH7.4，含有 0.01% SKL, 1mM DTT, 5% Trehalose和Proclin300.） |
| 性状 | 冻干粉 |
原理：
蛋白质的翻译效率很大程度上跟翻译起始效率有关，因此mRNA的5'端必须得很好翻译，最好不要有复杂的二级结构；通过PCR的方法在基因的5‘端引入简并序列，构建克隆，挑选多个克隆，诱导表达之，SDS-PAGE电泳检测表达量的高低，挑选高表达克隆进行测序。
实验步骤：
1.设计目的重组蛋白质的N端10-15个氨基酸的简并序列。
2.引物合成上述简并序列，同时设计合成目的基因反向引物。
3.PCR扩展目的基因，这样在目的基因的5‘端就引入了兼并序列，同时不改变氨基酸序列。
4.双酶切，插入到目标载体。
5.转化。
6.挑选多个克隆（比如100-200个）到1.5ml EP管，直接诱导表达（记得带上为改造克隆菌株的对照）。
7.SDS-PAGE检测。
8.挑选高表达的多个克隆，测序。
重组蛋白的特性
Immune tech的重组蛋白分为冻干粉和溶液态两种保存形式，原核细胞表达的重组蛋白为冻干粉状态，真核细胞表达的重组蛋白为溶液态保存，这样使得重组蛋白非常稳定，在-80℃条件下可保存数年。冻干粉在使用前需进行溶解，其中溶解的方法非常关键，因为溶解不好会降低蛋白的效用。溶液态保存的重组蛋白在冻融稀释使用过程中也需要仔细注意，这些都是用户在实际应用中经常遇到的问题。
（1）原核细胞表达的重组蛋白。Immune tech大肠杆菌表达的冻干重组蛋白，已经从包涵体中提纯，添加了蛋白保护剂，使用过滤后的无菌水作为复溶剂即可，复溶冻干蛋白100 μg，用86 μl的超纯水，轻轻摇晃使蛋白溶解，再用移液枪的枪头轻吹几下即可完全溶解，一定不能使用涡旋仪进行快速振荡或剧烈摇晃。
（2）真核细胞表达的重组蛋白。有活性的蛋白质不仅要转录和翻译，还要进行翻译后的加工，使得蛋白质的空间折叠方式维持正常，所以重组蛋白必须在真核细胞中进行，如哺乳动物细胞能够识别和去除基因中的内含子，对翻译后的蛋白质进行加工，这样表达的蛋白质具有生物活性。我们用溶液态来保存，保持了其良好的活性和稳定性。
（3）重组蛋白的保护剂。在冻干和储存过程中常用的保护剂或稳定剂有糖类，多元醇，聚合物，表面活性剂，某些蛋白和氨基酸等。我们通常加8%（质量比体积）的海藻糖和甘露醇作为冻干保护剂。海藻糖可明显阻止蛋白质二级结构改变以及冻干过程中蛋白质的伸展和聚集，甘露醇也是一种普遍应用的冻干保护剂和填充剂。
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文献和实验及0-2 mol/L 硫酸铵中的稳定性； c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性； d、测定样品在4-40℃的稳定性； e、室温下静置过夜，测定对蛋白水解酶的稳定性。 （2）样品预处理 a、去除样品中颗粒物（0.45-0.22微米膜过滤或者10000 g离心15分钟） b、去除样品中脂类（ 10000 g离心15分钟或有机溶剂抽提） c、去除样品中核酸（加入核酸酶消化或者使核酸沉淀） d、抑制样品中蛋白水解酶（加入蛋白酶抑制剂、低温下快速第一步分离或在蛋白酶缺陷宿主中表达重组蛋白
。pETcoco载体同时兼容了DE3调控模型， 在加入IPTG后诱导表达量达升高2500倍。 在保证质粒稳定性这一点上除了pETcoco的方法还有另一种方法就是 将重组质粒转化进入含有T7 RNA聚合酶抑制剂的T7溶菌酶表达基因的 菌株中，在含有pLysS的pLysE宿主菌内重组质粒的本底表达被进一步 抑制，质粒可以更稳定地存在。 Novagen提供多种表达使用的菌株，为了提高表达量做出了各种改 造，它们大致分为以下几个种类： 1. 蛋白酶缺陷型 所有B菌株的衍生株都是
后诱导表达量达升高2500倍。 在保证质粒稳定性这一点上除了pETcoco的方法还有另一种方法就是 将重组质粒转化进入含有T7 RNA聚合酶抑制剂的T7溶菌酶表达基因的 菌株中，在含有pLysS的pLysE宿主菌内重组质粒的本底表达被进一步 抑制，质粒可以更稳定地存在。 Novagen提供多种表达使用的菌株，为了提高表达量做出了各种改 造，它们大致分为以下几个种类： 1. 蛋白酶缺陷型 所有B菌株的衍生株都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型的，这包 括有B834
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