北京一站式MBP标签蛋白纯化套装厂家

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百奥莱博专业生产销*(代"售")北京一站式MBP标签蛋白纯化套装厂家，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：北京一站式MBP标签蛋白纯化套装厂家
英文名：One-Stop MBP-Tagged Protein Miniprep Pack
品牌：百奥莱博
编号：BTN130871
规格：2mL
MBP(麦芽糖结合蛋白，Maltose Binding Protein)标签蛋白大小为40 kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。MBP融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化，结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。如果要去除MBP融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测MBP标签标记的重组蛋白。由于MBP融合蛋白原核表达载体具有表达效率高，易于纯化等优点。在现代分子克隆中MBP常作为融合蛋白被广泛应用。本产品就是专门用于分离纯化MBP融合蛋白的试剂盒，其原理如下：


产品特点：
1．一站式套装，含所需的直链淀粉和琼脂糖介质、溶液和层析柱，操作非常方便。
2．提供 2mL直链淀粉-琼脂糖介质，其最大载量为10mg MBP蛋白/mL介质。
3．采用麦芽糖温和洗脱，无去污剂和变性剂对蛋白活性的影响。
4．本介质可以反复使用多次。

试剂盒组成：

 

成分	规格
直链淀粉-琼脂糖介质	2ml
1 M Tris-HCl(pH7.4)	25ml
0.1 M EDTA溶液	25ml
2 M NaCl溶液	50ml
蔗糖	20g
PMSF(10mg/mL)	1ml
0.1mM MgCl2溶液	50ml
0.1 M麦芽糖溶液	25ml
层析柱(6mL)	1支
说明书	1份

储存条件：常温运输和保存，但介质需4℃保存，PMSF需要-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
1．将直链淀粉-琼脂糖介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中(介质用量需要根据MBP蛋白产量决定，其最大载量为10mg MBP蛋白/mL介质，请根据实验需要取适量的介质加入层析柱中)。
2．用5倍柱体积(柱体积指的是填料介质的体积，下同)自备去离子水洗柱，共3次。
3．用5倍柱体积的新配的结合缓冲液洗柱，进行平衡，使填料介质处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。结合缓冲液的配方如下(以10mL为例)：

成分	用量	在结合缓冲液中的浓度
1M Tris-HCl(pH7.4)	0.2mL	20mM
0.1M EDTA溶液	0.1mL	1mM
2M NaCl溶液	1mL	200mM
自备去离子水	8.7mL	-

4．4℃ 5000g离心10分钟收集20mL表达菌液，弃上清，将细胞沉淀(约100mg)悬于2mL冰冷的现配的细胞洗涤液中，4℃ 5000g离心15分钟收集细胞沉淀后，再次悬于2mL冰冷的细胞洗涤液中。(最好用不加诱导物的菌液做对照样。)细胞洗涤液的配方如下(以10mL为例)：

成分	用量	在细胞洗涤液中的浓度
1M Tris-HCl(pH7.4)	0.1mL	10mM
2M NaCl溶液	0.15mL	30mM
自备去离子水	9.75mL	-

5．制备细胞裂解物：
1)如果所用载体不带MBP信号肽序列(如pMAL-c2)
a)超声破碎细胞，功率30 W，保持细胞低温(0℃)，直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。(超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。)
b)为使溶液澄清，向上述细胞洗涤液中加入35μl PMSF(10mg/mL)。
c)4℃下13000-15000g离心30分钟，以去除残留细胞和细胞碎片以防堵柱，收集上清样品，留样做 SDS-PAGE电泳对照，其余样品用于纯化MBP融合蛋白，直接进入第6步。
2)如果所用载体带MBP信号肽序列(如pMAL-p2)
a)4℃ 5000g离心15分钟收集细胞，沉淀悬于1mL冰冷的现配的细胞裂解液中。细胞裂解液的配方如下(以10mL为例)：

成分	用量	在细胞裂解液中的浓度
1M Tris-HCl(pH7.4)	0.3mL	30mM
0.1M EDTA溶液	0.01mL	0.1mM
蔗糖	2g	20%(m/V)
自备去离子水	加水到10mL	-

b)加入25μl PMSF(10mg/mL)，室温搅动15分钟，于4℃ 13000-15000g离心10分钟收集细胞。
c)旋动细胞沉淀，加入2mL冰冷的0.1mM MgCl2溶液，4℃搅动10分钟。
d)休克细胞4℃ 13000-15000g离心10分钟，在上清中加入10mM Tris-HCl(pH7.4)(可将1 M Tris-HCl，pH7.4稀释100倍配制而成)至pH为7.4。
e)上清用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，滤液用100倍体积的10mM Tris-HCl(pH7.4)(配方如上)4℃透析。
f)收集透析后样品，留样做 SDS-PAGE电泳对照，其余样品用于纯化MBP融合蛋白，直接进入第6步。
6．将样品加到平衡好的直链淀粉-琼脂糖介质中(保证目的蛋白与介质充分接触，以提高目的蛋白的回收率)，收集流出液。
7．用10-15倍柱体积的结合缓冲液(配方见上表)进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
8．使用5-10倍柱体积的现配的麦芽糖洗脱液洗脱结合的融合蛋白，收集洗脱液(即目的蛋白组分)。麦芽糖洗脱液的配方如下(以10mL为例)：

成分	用量	在麦芽糖洗脱液中的浓度
1M Tris-HCl(pH7.4)	0.2mL	20mM
0.1M EDTA溶液	0.1mL	1mM
0.1M麦芽糖溶液	1mL	10mM
自备去离子水	8.7mL	-

9．将纯化得到的样品(包括流出液、洗杂液和洗脱液)以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。
10．填料介质清洗：依次使用3倍柱体积的结合缓冲液和5倍柱体积的去离子水平衡介质，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。本介质可重复使用。
蛋白酶切割释放靶蛋白(可选步骤，所用试剂需自备)
11．用适当的蛋白酶切割融合蛋白释放靶蛋白。
1)加入自备的凝血酶、肠激酶或Xa因子(根据融合蛋白中的位点选择)。每毫升介质中加入50单位的溶于1mL PBS溶液的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀，室温下振荡2-16小时。
2)4℃以500 g离心5分钟，上清小心转移到新离心管中。
3)用传统的层析方法或SDS-PAGE电泳分离靶蛋白和蛋白酶。

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·酿酒酵母Y187感受态细胞
编号：BTN140389
英文名称：E.coli Y187 Rosetta Competent Cell
规格：10×100μL
 Y187菌株是Clontech公司开发的GAL4系统酵母单杂，双杂实验用菌株，MATα型，可直接转化质粒或与MATa型酵母菌株(Y2HGold，AH109等)通过mating 操作进行筛库试验。Transformation marker 为: trp1，leu2，报告基因为：lacZ，MEL1。Y187-GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。质粒PGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N 端1～ 174 位*基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒PGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C 端768～881 位*基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。GAL4 系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N 端1～174 位*基酸区段的DNA 结合域(DNA-BD)和位于C端768～881 位*基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD 单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD 不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD 融合，形成 bait 融合蛋白(bait -BD)和prey融合蛋白(prey-AD)，如果 bait和prey发生相互作用，就会促使 BD和AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。Y187 有两个报告基因：lacZ，MEL1，分别由两种不同的启动子(G1，M1)启动，这两种启动子只有GAL4 识别的17bp 核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。

 Y187感受态细胞是实验室常用酵母双杂用菌株，本产品经特殊工艺制作而成，经PGADT7质粒检测转化效率为104 cfu/μg DNA。

菌株基因型：MATα，ura3-52，his3-200，ade 2-101，trp 1-901，leu 2-3，112，gal4Δ，met–,gal80Δ，URA3: :GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ，MEL1

产品组成：

成分	规格
Y187感受态细胞	0.1ml×10支
PGADT7(control vector)，10 ng/μL	10μl
Carrier DNA，5μg/μL	100μl
PEG/LiAc	5ml
说明书	1份

储存条件：感受态细胞干冰运输、-80℃保存，Carrier DNA -20℃保存；PEG/liAC、PGADT7质粒4℃保存；有效期半年。

自备试剂：目的DNA、YPDA、SD培养基等。

使用方法：
1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μL，可以根据实际情况分装使用。
以下实验以100μL感受态细胞为例。
2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中依次加入预冷的目的质粒2-5μg，CarrierDNA(95-100℃ 5分钟，快速冰浴，重复一次)10μL，PEG/LiAc 500μL，吹打混匀，30℃水浴30分钟(15分钟时翻转6-8次混匀)。
3. 42℃水浴15分钟(7.5分钟时翻转6-8次混匀)。
4. 5000rpm离心 40秒，弃上清。取400μL ddH2O 重悬沉淀，5000rpm离心 30秒，弃上清。
5. 取 50μL ddH2O 重悬沉淀，涂板，29℃培养48-96小时。

注意事项：
1. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA 平板29℃，48h培养可见直径1mm 克隆；涂SD 单缺平板29℃，48-60h培养可见直径1mm 克隆，涂SD 双缺平板29℃，60-80h培养可见直径1mm 克隆，涂SD 三缺或四缺平板29℃，80-90h培养可见直径1mm 克隆。
2.菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine 被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine 合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole(AIR)在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
3.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
4. 同时转化 2-3 种质粒时可增加质粒的用量。

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