His标签蛋白琼脂糖纯化树脂供应

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北京百奥莱博专注于生命科学和生物技术领域，致力于为客户提供包括His标签蛋白琼脂糖纯化树脂供应在内的一系列分子生物学试剂产品，并提供一系列相关的技术服务。

名称：His标签蛋白琼脂糖纯化树脂供应
产地：国产|进口
编号：SY0392
英文名：Ni-NTA Agarose Resin
规格：10ml
品牌：百奥莱博
Ni-NTA Agarose Resin以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸（NTA）为配体，螯合镍离子（Ni2+）后，形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻，与Ni-IDA树脂相比，更加稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。已经成为实验室纯化His标签蛋白不可获取的树脂之一。

基质（Matrix）：高度交联的4%琼脂糖凝胶
孔径（Bead size）：45-165µm
载量（Capacity）：＞40mg 6×His-tagged protein/ml 基质
耐压（Tolerance Pressuremax）：0.1MPa, 1bar
储存缓冲液：含20%乙醇的1×PBS
储存条件：4℃，有效期2年。


使用方法

（一）纯化流程

1 缓冲液的准备
缓冲液使用原理：低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer 在使用前最好用0.22µm或0.45µm滤膜过滤除菌。可溶性组*酸标签蛋白纯化所需配方详见附表1。包涵体组*酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表2。

2 样品准备
2.1 细菌表达的蛋白（本说明以细菌表达的蛋白纯化为例）
1）挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
2）表达结束后，将培养液转至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体，然后加入1/10体积的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（PMSF在破碎前加入，其终浓度为1mM），同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
3）之后加入溶菌酶，使其工作浓度为1mg/ml。【注】：如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。
4）将菌体沉淀悬浮起来（如果菌液浓度高，可考虑加入10µg/ml RNase A和5µg/ml DNase I），混匀，置于冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。
5）收集上述澄清蛋白液，10000rpm，4℃离心20-30min。取上清0.22µm或0.45µm滤膜过滤后置于冰上备用或-20℃保存。
2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白
将细胞培养液转移至离心瓶，5000rpm离心10min，收集上清。如上清中不含EDTA、组*酸和还原剂等，即可直接上柱纯化；如含有EDTA、组*酸和还原剂等物质，则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
【注】：对于大量体积的上清，需加入硫*(代"酸")铵进行沉淀浓缩，之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。
2.3 包涵体蛋白纯化（以细菌为例）
1）将培养液转移至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体去上清。
2）按照菌体：裂解液=1:10（w/v）的比例将菌体充分悬浮，混匀，冰浴超声破碎。
3）将破碎液转移至离心管，10000rpm，4℃离心20-30min，去上清。可重复步骤2）和3）一次。
4）按照菌体：裂解液（含8M尿素）=1:10（w/v）的比例将包涵体充分悬浮。
5）变性条件下纯化His标签蛋白纯化。

3样品纯化

1）装柱：将Ni-NTA Agarose Resin借助重力的作用装入合适的纯化柱中。
2）清洗：3-5倍柱体积去离子水冲洗色谱柱。
3）平衡：至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。
4）上样：注意控制加样速度，确保目的蛋白与Ni2+充分接触，以提高纯化得率。
【注】：注意收集流出液，用于后续SDS-PAGE检测蛋白的结合情况。
5）平衡/洗杂：Wash Buffer 平衡柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。注意收集流出液。
【注】：在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。
6）洗脱：使用5-10倍柱体积Elution Buffer洗脱，收集洗脱液即目的蛋白溶液。
7）清洗：依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。
【注】：建议在清洗之前用更高浓度咪唑（如500mM）彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。
8）保存：5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂，最后将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。

4 SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

（二）在位清洗
当填料使用过程中发现反压过高（＞0.5Mpa）或者填料上面出现明显的污染时，需对其进行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。在位清洗时，先把Ni2+脱掉，清洗结束后，将填料保存在20%乙醇中，后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

1 去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类
使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积，接触时间为15-20min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1M醋酸溶液，接触时间为1-2h。去污剂处理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱体积，彻底去除去污剂。最后利用去离子水清洗10倍柱体积。

2 去除离子作用结合的蛋白
使用1.5M NaCl 溶液接触10-15min，之后用去离子水清洗10倍柱体积。

（三）填料再生

当填料使用过程中发现反压过高，填料上面出现明显的污染，或填料载量明显变低时，需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理，即填料再生。按照下面操作流程进行：

1）使用0.2M 醋酸溶液（含6M GuHCl）清洗2倍柱体积；
2）去离子水清洗5倍柱体积；
3）2%SDS清洗3倍柱体积；
4）去离子水清洗5倍柱体积；
5）乙醇清洗5倍柱体积；
6）去离子水清洗5倍柱体积；
7）100mM EDTA（pH 8.0）清洗5倍柱体积；
8）去离子水清洗5倍柱体积；
9）100mM NiSO4清洗5倍柱体积；
10）去离子水清洗10倍柱体积。

填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃备用。


附表1 可溶性His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

 

缓冲液名称	配方	配制1L溶液所需各种试剂量
Lysis Buffer (pH8.0)	50mM NaH2PO4 300mM NaCl 10 mM imidazole NaOH调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.8g NaCl             17.54g Imidazole         0.68g
Wash Buffer (pH8.0)	50mM NaH2PO4 300mM NaCl 20 mM imidazole NaOH调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.8g NaCl             17.54g Imidazole         1.36g
Elution Buffer(pH8.0)	50mM NaH2PO4 300mM NaCl 250 mM imidazole NaOH调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.8g NaCl             17.54g Imidazole         17.0g

附表2 包涵体His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

缓冲液名称	配方	配制1L溶液所需各种试剂量
Lysis Buffer (pH8.0)	8M Urea 100mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 盐*(代"酸")溶液调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤除菌	Urea             480.5g NaH2PO4 ·2H2O    15.6g Tris              15.76g
Wash Buffer (pH6.3)	8M Urea 100mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 盐*(代"酸")溶液调pH至6.3, 0.22µm或0.45µm过滤除菌	Urea             480.5g NaH2PO4 ·2H2O  15.6g Tris              15.76g
Elution Buffer(pH4.50)	8M Urea 100mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 盐*(代"酸")溶液调pH至4.5, 0.22µm或0.45µm过滤除菌	Urea             480.5g NaH2PO4 ·2H2O    15.6g Tris             15.76g

附表3 Ni-NTA Agarose Resin试剂耐受情况

试剂种类	浓度
还原剂	5mM DTE 0.5-1 mM DTT 20mM β-mercaptoethanol 5mM TCEP 10mM reduced glutathione
变性剂	8M urea 6M Gua-HCl
去污剂	2% TritonTM X-100(nonionic) 2% TweenTM20(nonionic) 2% NP-40(nonionic) 2% Cholate (anionic) 1% CHAPS (zwitterionic)
其他类	500mM imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100mM Na2SO4 1.5M NaCl 1mM EDTA 60mM citrate
缓冲液	50mM sodiu*(代"m") phosphate, pH7.4 100mM Tris-HCl, pH7.4 100mM Tris-acetate, pH7.4 100mM HEPES, pH7.4 100mM MOPS, pH7.4 100mM sodiu*(代"m") acetate, pH7.4

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ARB12504 大鼠绒毛膜促性腺激素β(β-CG)酶联免疫定量检测 Rat chorionic gonadotrophin β,β-cg ELISA KIT
SJ0788 *化乙酰胆碱
GST琼脂糖凝胶4FF VK3
CYB165010 HRP标记生物素
ARB10719 人军团菌抗体IgA(LP Ab-IgA)elisa检测 Human legionella antibody iga,lp ab-iga ELISA KIT
PY02-076  硝酸盐动力培养基  250克  
ARB13404 红螯光壳螯虾卵黄脂磷蛋白/卵黄磷蛋白(Lv/Vn)血清中含量检测 Cherax quadricarinatus lipovitellin/vitellin,lv/vn ELISA KIT
79-06-1 Random Primers 随机引物
*基脲 IPA-K 57-56-7
H0501 大牛血浆(去红细胞、无菌过滤)
F030111 HRP标记羊抗乙肝核心抗原抗体 HRP*Polyclonal Goat Anti-HBcAg
1185-53-1 TRIS-HCl  Tris盐*(代"酸")
ARB12371 大鼠肾上腺素能A1A受体(ADRA1A)elisa检测操作说明书 Rat adrenergic alpha-1a receptor,adra1a ELISA KIT
ARB12396 大鼠泌乳素(ProlActIn)Elisa分析 
BL0854 兔抗马IgG纯化抗体
224967-52-6 MethyleneGreen 次甲基绿
PY02-021  乳糖复发酵胨水  250克  
BTN131192 超敏化学发光(AP)检测试剂盒 Ultrasensitive ECL Kit
D0201 脱纤维山羊血(无菌 pet瓶装)
维生素K3 K-Lyte 58-27-5
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·Alexa Fluor 488标记驴抗小鼠IgG(H+L)
编号：SY0721
英文名称：Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)
规格：100μl
本品是由Alexa Fluor 488标记的驴抗小鼠IgG（H+L），使用抗原偶联的琼脂糖微珠从驴抗血清内亲和色谱纯化所得。免疫电泳和/或ELISA法检测显示本品特异性结合完整的小鼠IgG分子，也会与其他小鼠免疫球蛋白的轻链结合。本品不会识别非免疫球蛋白类的血清蛋白，但可能会与其他物种免疫球蛋白发生交叉反应。

Alexa Fluor 488的光谱性质同FITC，Amax（最大激发波长）为493nm，Emax（最大发射波长）为519nm。本品适合做多标实验，广泛应用于多种免疫学实验如免疫细胞化学（ICC），流式细胞术（FC）以及免疫组化（IHC）等。

浓度：0.75 mg/ml
缓冲液：0.005M 磷酸*，0.125M *化*, pH 7.6
稳定剂：7.5mg/ml BSA（无IgG，蛋白酶），50% 甘油
防腐剂：0.025% 叠氮化*
推荐稀释比例：1:50～400（适合多数实验）
储存条件：-20℃，避免反复冻融，有效期一年。


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·RIPA裂解液(中)
编号：SY0316
英文名称：RIPA Lysis Buffer (Medium)
规格：100ml
本品属于裂解强度居中的RIPA裂解液，含有sodiu*(代"m") orthovanadate，sodiu*(代"m") fluoride，EDTA，leupeptin等多种抑制剂，可以有效抑制蛋白降解。裂解得到的蛋白样品可用于常规的Western、IP等实验。

RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)，其本意是Radio Immunoprecipitation Assay，是一种传统的细胞组织快速裂解液，对动物细胞胞膜、胞浆、胞核成分均有裂解作用。根据其裂解液的强度不同，大致可以分为强、中、弱三类。

注意事项
1）需自备PMSF。
2）裂解样品的所有步骤都需在冰上或4℃进行。
3） 用RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其蛋白浓度（SY0298）。由于含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。
4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：

(一) 细胞样品

1）融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液清洗细胞一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250μl 裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。
悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250μl 裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成5×105～1×106个细胞/管，然后再裂解。
3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入150μl裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200μl或250μl。

（二）组织样品：

1）把组织剪切成细小的碎片。
2）融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
3）按照每20mg组织加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)
4）用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。
5）充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
6）如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得充分。
【注】：RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。

储存条件：-20℃，避免反复冻融，有效期12个月。

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