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- 2025年07月15日
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上海一基
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文献和实验我做NF-kB的EMSA实验方法和结果，条带不好，请大家指点！
。 （7）吸取上清，为核蛋白提取物。 （8）马上进行EMSA实验。 探针制备： 用γ-32P-ATP及T4多核苷酸激酶对合成的转录因子结合和突变型寡核苷酸的两条互补链分别进行末端标记。20 µl反应总体积中，加寡核苷酸10 pmol，10×T4多聚核苷酸激酶缓冲液2µl，γ-32P-ATP 3 pmol，T4多核苷酸激酶10 u，37 ℃反应45 min，再置于68 ℃ 10 min灭活。在离心管中加入退火反应液60 µl，互补配对的两条链的标记产物各20 µl，于95 ℃变性5min，缓慢降温
非常高，一般情况下同位素是首选。如今Atlas SpotLight标记试剂盒特别提供逆转录所需的试剂，可以将2μg以上的mRNA或者50μg以上的RNA样品制备成生物素标记的单链cDNA探针，由于没有竞争性抑制，单链探针的灵敏度要大大高于双链探针。另外生物素标记的探针比32P标记的探针要稳定，可以在半年内多次重复使用。 对于Southern、Northern和多组织Northern预制杂交膜（MTN）、多组织表达矩阵（MTE）等以尼龙膜为基质的杂交、印迹反应，可以选用SpotLight随机引物标记试剂盒
MacroArray（包括尼龙膜基质和塑料基质）提供的基因特异引物混合物（CDS Primer）、同位素标记物和逆转录酶，直接在磁珠上合成同位素标记的cDNA探针，最后从磁珠上洗脱标记好的探针，纯化后即可用于杂交。这个标记试剂盒可以从少至10μg的total RNA中制备适用于Clontech公司各种尼龙膜基质和塑料基质MacroArray的高质量cDNA探针。由于将mRNA纯化和cDNA探针合成、标记合为一体，方便用户的同时还可节约成本。这个系统不适用于玻片芯片的探针标记。 4） Clontech公司
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