PKM2重组蛋白

PKM2重组蛋白主要有原核表达系统和真核表达系统和无细胞表达系统。
英文名称：Recombinant Pyruvate Kinase, Muscle (PKM2)
M2PK; PKM; M2-PK; PKM1; CTHBP; OIP3; PK3; PKM; TCB; THBP1; Pyruvate kinase muscle isozyme; Thyroid hormone-binding protein 1; Cytosolic thyroid hormone-binding protein 
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物种Homo sapiens (Human，人)相同的名称，不同的物种。来源原核表达宿主E.coli内毒素水平<1.0EU/µg(LAL法测定)亚细胞定位细胞膜, 分泌预测分子量25.9kDa实际分子量28kDa(差异分析请参阅说明书)片段与标签Arg25~Ser234 with N-terminal His Tag缓冲液成份20mM Tris, 150mM NaCl缓冲液（pH8.0, 含有1mM EDTA, 1mM DTT, 0.01% SKL, 5% Trehalose和Proclin300）性状冻干粉纯度> 90%等电点8.2应用Positive Control; Immunogen; SDS-PAGE; WB.如果需要有生物活性的蛋白，请参见活性蛋白。规格10ug50ug200ug1mg1g
用法：Reconstitute in 20mM Tris, 150mM NaCl (pH8.0) to a concentration of 0.1-1.0 mg/mL. Do not vortex.
PKM2重组蛋白储存：避免反复冻融。2-8°C不超过一个月，-80°C不超过12个月。
稳定性：热稳定性以损失率显示。损失率是由加速降解试验决定，具体方法如下：在37°C孵育48小时，没有显著的降解或者沉淀产生。保质期内，在适当的条件下存储，损失率低于5%。

PKM2重组蛋白原核表达鉴定详细实验步骤
1. 表达鉴定第一天的任务，常用抗性选择根据感受态细胞选择
1）拿到质粒，离心（3000r/min；2min) · 在质粒中加入 TE【使质粒最终加入到 110μL 感受态细胞中的量为 80-100ng，据此确定加入 TE 的量】，一
般为(1μg 质粒加 20μLTE；2μg 质粒加 50μLTE；5μg 质粒加 100μL TE) · 将质粒与 TE 混匀，吸取 2μL 混液与感受态细胞混匀
2）将感受态细胞放入冰箱（4℃）中，30min
3）取出后立即放入水浴锅中（42℃），热激 90s,
PKM2重组蛋白活性蛋白整体方案Active Protein Solutions
 4）再次放入冰箱（4℃）中，3min
5）拿出后取 200μL 的 LB 液体培养基加入到已转入质粒的感受态细胞中
6）放入摇床（37℃; 195r) 中, 30nim 至 60min; (最佳 45min)
7）取出离心（3000r/min；2min) · 去掉 200μL 的上清，留 100μL 左右上清悬浮沉淀，吸取 50μL 悬液涂平板，【先将对应抗性的平板放入培养箱（37℃）中预热 20min】
8）把平板放入培养箱（37℃），过夜（12h 至 16h）
2. 表达鉴定第二天的任务，注意 Pcold 表达载体的表达温度
1）每个平板挑取单菌落至 4 支对应抗性的 LB(4ml)试管中，编号为“0”“1”“2”“3”
2）将试管放入摇床（37℃；195r) 中，【单抗 3h 左右；双抗 4h 左右；刚开始用可见分光光度计测 OD 值；熟练后可目测（背光下，以试管中的枪头为例，刚刚看不见枪头即可）】，测 OD 值（0.6 至 0.8）
3）从“0”号管中取 700μL 悬液加入到 100μL（C=80%）的保种甘油中，震匀，放入冰箱（-20℃）冻存
4）在每组菌的“1”“2”“3”号试管中分别加入 2μL 的 IPTG【终浓度 0.5mM 最适，可根据日后表达摸索】
5）视不同的载体选择适合的表达环境【PET/PGEX：15℃表达过夜；25℃表达 6h；37℃表达 3h 至 4h（4 支
试管，“0”“1”号试管 15℃表达过夜；“2”“3”试管 37℃表达 3h 至 4h）。Pcold：【全部 15℃表达过夜】
3. 表达鉴定第三天，全菌的表达鉴定分析，注意控制溶质的量及溶液黏度
1）从每组 4 支的试管中均取 500μL 菌液加入到 1.5ml 离心管中，【若 OD 值不一样，值小的可多取】离心
（6000r/min)，5min, 去上清，留沉淀【沉淀少的，可再取菌液离心，尽量使沉淀量接近】
2）在每个离心管中加入 500μL 的 DDH2O,悬浮沉淀，离心（6000r/min)，5min, 去上清，留沉淀
· 在每支离心管中加入 45μL 的 1×PBS 和 45μL 的 2×Loading Buffer 悬浮沉淀【当溶质适量且均一的情况
下，加入量不变；当溶质多且粘稠时，应使加入量增大，为降低粘度也可减少上液量】
3）放入煮样器（100℃） 25min
4）取出后离心（6000r/min) 3min, 电泳检测。
5）蛋白表达量不错，进行蛋白纯化；蛋白表达量低或者没表达，可参考原核表达 FAQ 相对应解决方案解决。
4. 蛋白纯化：见蛋白纯化专题。
PKM2重组蛋白为什么要纯化：
重组蛋白一般用转基因动物的乳腺产生，所以获得的重组蛋白是存在于动物的乳汁当中的。而显然在乳汁中存在大量不同种类的蛋白、糖、脂肪等物质，所以为了获得高纯度的重组蛋白，必须对获得的乳汁进行抽提和纯化。
在原核蛋白表达体系中，如 E.coli（大肠杆菌表达系统），外源基因通常需要诱导剂的诱导才能进行表达，本文详细讲述了常用诱导剂 IPTG 诱导原理，对外源蛋白诱导表达原理以及实验步骤。
原核生物绝大多数的基因按功能相关性成簇地排列，且密集于染色体上，共同形成一个转录单位——操纵子，也称基因表达的协同单位。E.coli 的乳糖操纵子含 Z、Y 及 A 三个结构基因，分别编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、通透酶（permease）和乙酰基转移酶（transacetylase)；此外还有调控基因：操纵序列 O（operator）、启动序列 P（promoter）；而 I(编码 Lac 阻遏物，Lac repressor)不属于乳糖操纵子。