实时荧光定量PCR的预混体系(探针法) 核酸扩增(PCR)

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

北京百奥莱博专业生产供应实时荧光定量PCR的预混体系(探针法) 核酸扩增(PCR)，我公司销*(代"售")全品类的分子生物学试剂，价格优惠，欢迎广大科研工作者垂询订购。

名称：实时荧光定量PCR的预混体系(探针法) 核酸扩增(PCR)
英文名：BaldStar TaqMan Mixture
产地：国产|进口
品牌：百奥莱博
编号：WE0144
  本品是专用于探针法(TaqMan，Molecular Beacon等)实时荧光定量PCR的预混体系，浓度为2×，包含BaldStar Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs和Mg2+，操作简单方便。主要用于基因组DNA靶序列和RNA反转录后cDNA靶序列检测，如基因表达分析，拷贝数分析，SNP基因型分析等，适用于不同类型探针法荧光定量。本品含有的BaldStar Taq DNA Polymerase是一种经化学修饰的、全新高效热启动酶，在常温下没有聚合酶活性，有效避免了在常温条件下由引物和模板非特异性结合或引物二聚体而产生的非特异性扩增，酶的激活须在95℃下孵育10分钟。独特的PCR缓冲体系与热启动酶的组合，显著提高了PCR的扩增效率，荧光信号更强，灵敏度更高，可以检测单拷贝的模板。使用本产品可以得到更广的线性范围，对目的基因定量更准确。适用于无需ROX作为校正染料的所有荧光定量PCR仪。

  ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR 扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同，因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
不需要ROX校正的仪器(WE0144)：
Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96等。
需要Low ROX校正的仪器(WE0145)：
ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio® 3 System，QuantStudio® 5 System，QuantStudio® 6 Flex System，QuantStudio® 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
需要High ROX校正的仪器(WE0146)：
ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

产品组成：

 

组份	WE0144-5ml	WE0145-5ml	WE0146-5ml
2×BaldStar TaqMan Mixture	5×1ml	5×1ml	5×1ml
50×Low ROX	-	200μl	-
50×High ROX	-	-	200μl
ddH2O	5×1ml	5×1ml	5×1ml

注意事项：
1．使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2．避免反复冻融本品，反复冻融可能使产品性能下降。本产品长期保存可置于-20℃，避光。如果在短期内需要频繁使用，可在2～8℃保存。

使用方法：
以下举例为常规PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系：
 

试剂	50μl反应体系	终浓度
2×BaldStar Taq Man Mixture	25μl	1×
Forward Primer，10μM	1μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	1μl	0.2μM
Probe，10μM	1μl	0.2μM
Template DNA	2μl
50×Low ROX or High ROX(可选)	1μl	1×
ddH2O	up to 50μl

注意：
1)通常引物浓度以0.2μM可以得到较好结果，可以在0.1-1.0μM作为设定范围的参考。
2)使用的探针浓度，与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。
3)通常DNA模板的量以10-100ng基因组DNA或1-10ng cDNA为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。
4)不同仪器的激发光学系统有所不同，根据使用荧光定量的仪器选择加入50× Low ROX or 50×High ROX。

2、PCR反应程序：
注意！本产品预变性反应必须在95℃ 10分钟下完成！

两步法PCR：

步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	10 min
变性	95℃	15 s	35-40个循环
退火/延伸	60℃	1 min

注意：
1)本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、10 min条件下实现酶的活化。
2)建议采用两步法PCR反应程序，若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考。

储存条件：-20℃，避免反复冻融

关于实时荧光定量PCR的预混体系(探针法) 核酸扩增(PCR)的更详细说明，请致电我公司咨询，我们将以最饱满的热情为您提供解答，此外，我公司专业供应下列产品：
PY02-022  乳糖发酵培养基  250克  
ARB11107 人乳头状瘤病毒抗体IgM(HPV-IgM)血清中含量检测 Human papillomavirus igm,hpv-igM ELISA KIT
ARB12803 小鼠β葡萄糖醛酸苷酶(βGD)代做ELISA实验 Mouse β-glucuronidase,βgd ELISA KIT
DL-天冬酰胺一水物 DL-Glutamic acid monohydrate 3130-87-8
50-02-2 Dexamethasone  地塞米松
1,1-二蒽醌亚胺 Potassium tungstate 82-22-4
9000-81-1 乙酰胆碱酯酶 Acetylcholinesterase
ARB13600 兔子补体片断3A(C3A)elisa检测操作说明书 Rabbit complement fragment 3a,c3a ELISA KIT
邻*二甲*(代"酸")二(2-甲氧基)乙酯 5-Fluorocytosine 117-82-8
ARB10680 人血管舒缓激肽(BK)ELISA检测服务 Human bradykinin,bk ELISA KIT
F030407 胶体金标记山羊抗小鼠IgG2b抗体 Goat Anti-Mouse IgG2b*GOLD
ARB11191 人降解加速因子(DAF)elisa检测 Human decay-acceleRating factor,daf ELISA KIT
ARB14163 大鼠流行性出血热(EHF)检测服务 
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ARB11643 人蛋白C(PC)血清中含量检测 Human protein c,pc ELISA KIT
2-(N-玛啡啉)乙磺酸*盐 OFLX 71119-23-8
PY01-059  肌酸  10克  
ARB13170 小鼠核因子κB亚基p65亲和肽(NF-κB p65)Elisa定量检测 Mouse nuclear factor-κb p65,nf-κb p65 ELISA KIT
DP439 石蜡包埋总RNA提取试剂盒
ARB12804 小鼠β葡糖苷酶(β-glucosIdAse)含量测试 Mouse β-glucosidase ELISA KIT
F030632 FITC标记小鼠抗猪IgG抗体 Monoclonal Mouse Anti-Pig IgG*FITC
E0502 抗凝驴血(无菌 袋装)
002005 草酸*抗凝羊血 100ml|500ml
ARB12052 大鼠三碘甲状腺原*酸(T3)elisa检测说明书 Rat tri-iodothyronine,t3 ELISA KIT
ARB13127 小鼠促性腺激素释放激素(GnRH)elisa检测操作说明书 Mouse gonadotropin-releasing hormone,gnrh ELISA KIT
F030442 胶体金标记小鼠抗鸭IgY(IgG)抗体 Monoclonal Mouse Anti-Duck IgY*GOLD
3-吲哚乙酸* MTB 6505-45-9
BTN130576 小鼠抗HA标签单抗 Anti HA-Tag Mouse Mab
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·HRP标记抗c-Myc标签单克隆抗体
编号：WE0333
英文名称：HRP Conjugated Anti c-Myc Tag Mouse Monoclonal Antibody
规格：20μl|100μl
本抗体为经辣根过氧化物酶(HRP)直接标记的抗c-Myc标签鼠单克隆抗体，可高度特异识别重组蛋白C末端或N末端的c-Myc标签(EQKLISEEDL)， 而不受邻近*基酸组成的影响，可用于检测c-Myc Tag融合蛋白。本产品经HRP直接标记，无需使用二抗，可直接用相应酶底物显色或化学发光法检测目的蛋白，减化了实验步骤，避免由二抗交叉反应引起的非特异性条带。

抗体类型：鼠IgG
免疫原：人工合成多肽
标记物：HRP
应用范围：WB(1：1000-5000)、ELISA(1：1000-20000)

·固定组织RNA提取试剂盒
编号：WE0196
英文名称：RNAtiqu FFPE RNA Extraction Kit
规格：50次
  本试剂盒适用于从福尔马林固定、石蜡包埋的组织中有效纯化总RNA。适合从小于30 mg的石蜡包埋组织或切片中抽提高纯度的总RNA，本试剂盒无需使用酚/*仿抽提和异丙醇沉淀，一小时内即可完成多个样品的抽提。本品使用专门优化的裂解液和蛋白酶K，释放福尔马林固定或组织切片样本中的RNA，无需过夜操作；消化后的样品在较高的温度孵育后，去除由福尔马林交联造成的抑制作用，有效释放组织切片中的RNA，而避免危害RNA的完整性；优化的缓冲系统使裂解液中的RNA可特异结合到硅胶吸附膜上，而其他污染物可流过膜；可通过漂洗步骤有效去除，经过洗脱的RNA可直接用于RT-PCR、Real-Time PCR和印迹分析等实验。

试剂盒组成：

组份	50次
Buffer GTL	15ml
Buffer GL	25ml
蛋白酶K	12.5mg
蛋白酶K 储存液	1.25ml
Buffer RW2(浓缩液)	11ml
RNase-Free Water	10ml
过滤柱FM及收集管	50套
吸附柱RS及收集管	50套
RNase-Free离心管(1.5ml)	50个

自备试剂：无水乙醇(新开封或提取RNA专用)、10mM PBS(PH7.4)(固定液中的组织)。

产品特点：
1、安全－无酚*仿等有机物抽提。
2、快速－可在一小时内完成实验。
3、高效－提取RNA得率高、纯度好。
4、可从石蜡包埋或福尔马林固定样品中提取高纯RNA。

实验前准备及重要注意事项/strong>：
1、向蛋白酶K 中加入0.625ml 蛋白酶K 储存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。
2、预防RNase污染，应注意以下几方面：
1)使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
2)玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M的NaOH中浸泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。
3)配制溶液应使用无RNase的水。
4)操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
3、获得样品后，要尽快将样品在4%-10%的福尔马林中固定，固定时间以14-24小时为宜，时间过长易导致RNA断裂，影响下游实验。
4、确保包埋前的样品彻底脱水，残留的福尔马林会抑制蛋白酶K 的作用。
5、第一次使用前应按试剂瓶标签说明先在Buffer RW2中加入无水乙醇。
6、使用前请检查Buffer GTL和Buffer GL是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将Buffer GTL和Buffer GL于56℃水浴重新溶解。

操作步骤：
1、样本处理：
① 石蜡包埋样本：用手术刀将组织块中多余的石蜡修剪掉，露出组织。
② 福尔马林等固定液中的样本：取约20 mg的样本，切成小块，置于离心管中，加入500μl 10mM PBS(PH7.4),涡旋振荡，12000rpm(～～13400×g)离心1分钟，重复3次，可直接进行第7步操作。
2、将组织块切成5-10μM的薄片。
注意：如果样品表面已经暴露在空气中，请将接触空气的2-3片弃掉不用。
3、取约1×1cm2的切片(共约4-5片切片)置于离心管(自备)中，加入1ml二甲*，盖紧管盖，涡旋震荡10秒。
4、12000rpm离心2分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。
5、加入1ml无水乙醇，涡旋震荡混匀。12000rpm离心2分钟，弃上清，注意不要吸弃沉淀。
注意：乙醇可以除去样品中残余的二甲*。
6、打开管盖，室温或最高至37℃孵育10分钟，直至无乙醇残留。
7、加入150μl Buffer GTL，重悬沉淀；加入10μl 蛋白酶K ，涡旋震荡混匀。
8、56℃孵育15分钟，直至样品完全溶解。80℃孵育15分钟。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
注意：
1)此步骤的目的是修复由甲醛变性的核酸，孵育的温度过高或时间过长可能造成RNA断裂，产生RNA碎片。
2)56℃孵育后的样品可置于室温，直至水浴锅或干浴锅温度达到80℃后再把样品置于80℃孵育。
9、加入320μl Buffer GL，涡旋震荡彻底混匀。
10、将步骤9中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的过滤柱中。12000rpm离心1分钟，收集滤液。
11、在步骤10得到的滤液中，加入720μl无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。
注意：加入无水乙醇后，可能有少量沉淀物析出，但不影响后续操作。
12、将步骤11中所得的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
13、向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
14、重复步骤13。
15、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。
注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应(酶切、PCR等)。
16、将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-50μlRNase-Free Water，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-20℃保存RNA。
注意：
1)RNase-Free Water体积不应小于20μl，体积过小影响回收率。
2)如果要提高RNA的产量，可用20-50μl新的RNase-Free Water重复步骤16。
3)如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤16。

储存条件：室温(15～30℃)。

北京百莱博科技有限公司专业生产供应销*(代"售")生物试剂、化学试剂、抗原抗体、血清血浆、Elisa试剂盒，更多试剂产品需求，欢迎来电咨询选购实时荧光定量PCR的预混体系(探针法) 核酸扩增(PCR)。