人胆管癌组织源细胞

原代细胞	细胞株
生长较快（5-7天铺满单层）	较快
高	低
高	低
有限	较多
饱满且旋涡状排列	单薄且多颗粒物质
阳性反应强	阳性反应弱
细胞生长稳定良好	易发生形态生理变化

人胆管癌组织源细胞
1.产品名称：人胆管癌组织源细胞
2.组织来源：胆管组织
3.产品规格：5×10^5cells/T25细胞培养瓶
4.细胞简介：
5.消化方式：
成分：0.1% Collagenase-2，0.1%胰酶
时间：20min
温度：37℃
6.细胞原代分离、培养基本操作步骤：
a.腹腔注射钠麻醉处死大鼠，腹部喷75%酒精消毒，无菌条件下取出胸部主动脉组织；
b.去除主动脉组织表面的脂肪和结缔组织，HBSS清洗2次，解剖显微镜下倒置主动脉，15ml离心管中加入3ml胶原酶消化液，37℃消化20min，消化期间每10min轻轻充分吹打细胞消化液，使细胞尽量脱落；
c.用200目细胞筛滤去未消化部分组织，之后1500rpm离心5min；弃上清，沉淀细胞加3ml完全培养液重悬，
d.然后，用0.1%胰酶消化组织20min，消化期间每10min轻轻充分吹打细胞消化液，使细胞尽量脱落；
e.用200目细胞筛滤去未消化部分组织，之后1500rpm离心5min；弃上清，沉淀细胞加3ml完全培养液重悬。
f.将c和e步骤重悬培养液混匀后接种于25cm2培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱中培养2h；最后，轻轻吸出瓶中培养基，之后往瓶中加入5ml新鲜完全培养基继续培养。
原代细胞的取材：
    人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，是进行细胞培养的第一步，若取材不当，将会直接影响细胞的体外培养，现将取材的基本要求和注意事项叙述如下:
   一、取材的基本要求
      （1）取材要注意新鲜和保鲜。新鲜组织易于培养成功，取材后应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h。
      （2）取材应严格无菌。所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。
     （3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。
     （4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。
     （5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。
     （6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。
   二、各类组织的取材技术
      (一)皮肤和粘膜的取材
皮肤和粘膜是上皮细胞培养的重要组织来源，主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4cm2即可，这样局部不留疤痕，若对烧伤皮肤进行上皮细胞膜片移植，可从大腿或臀部取较大皮片，可取2~4cm2皮片，但取材时不要用碘酒消毒；若培养上皮细胞，取材时不要切取太厚，尽可能去除所携带的皮下或粘膜下组织；若欲培养成纤维细胞，则反之。皮肤粘膜与外界相通部位，因表面细菌、霉菌很多，取材时应严格消毒，必要时要用高浓度抗菌素和适量两性霉素B漂洗、浸泡。
     (二)内脏和实体瘤的取材
内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织，否则培养后，由于成纤维细胞的生长给以后的培养工作增加困难。
     (三)血液细胞的取材
血液及淋巴组织中的血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝，通常采用肝素抗凝，常用肝素浓度为8~10u/mL血，抽血的针筒也要用肝素湿润，若从血站取来的献血员的血液，因血站不用肝素抗凝剂，常用含枸椽酸盐抗凝，对此类血标本千万不能用含钙、镁离子的洗液来处理细胞，因此时的钙、镁离子可加速血液中凝血酶促进血液凝固而影响收获血细胞及淋巴细胞。此外要严格无菌，尽量新鲜使用。
     (四)骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材
取上述标本时，除严格无菌，注意抗凝外，还要尽快分离培养，一般无需其他处理，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。
原代细胞的使用方法:
按技术部标准操作流程下，人胆管癌组织源细胞可传3-5代；建议您收到细胞后尽快进行相关实验。
客户收到细胞后，请按照以下方法进行操作。
1. 取出T25细胞培养瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5%CO2、饱
和湿度的细胞培养箱中静置3-4h，以稳定细胞状态。
2. 待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。
3. 细胞传代
1) 吸出T25细胞培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；
2) 添加0.25%胰蛋白酶消化液1mL至培养瓶中，轻微转动培养瓶至消化液覆盖整个培
养瓶底后，吸出多余胰蛋白酶消化液，37℃温浴1-3min；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后，再加入5ml完全培养基终止消化；
3) 用吸管轻轻吹打混匀，按1:2-1:3适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养；
4) 待细胞完全贴壁后，培养观察；之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。
三、注意事项
1. 培养基于4℃条件下可保存3-6个月。
2. 在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作。
3. 传代培养过程中，胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态。
4. 建议客户收到细胞后前3天每个倍数各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和与我们技术部沟通；由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，详尽告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪、回访直至问题得到解决。
5. 该细胞只可用于科研。
备注：由于实验所用试剂、操作环境及操作手法的不同，以上方法仅供各实验室参考。