1. DNA-RNA杂合链中去除RNA:
a. 用反转录酶,例如RT M-MuLV反转录酶或RT M-MuLV反转录酶(RNase H-)合成cDNA第一条链,70℃孵育10分钟终止反应。
b. 在冰浴上向已经合成第一条链的20µl反应体系中依次加入如下试剂:
Reaction Buffer (10X)————2µl
无核酸酶去离子水——————217.8µl
RNase H (5U/µl)——————20.2µl
c. 按上述体系配好之后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
d. 37℃孵育1小时。
e. 加入2.5µl 0.5M EDTA(pH8.0)混匀,以终止反应。
f. 后续可以使用酚氯*(代"仿")抽提、乙醇沉淀等方法纯化合成的双链cDNA,也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(YT009)可以向订购。
说明:其他情况DNA-RNA杂合链中去除RNA的条件可以参考上述条件进行。RNase H反应的pH范围约在7.5-8.3均可。
2. 杂合链中RNA的去除和cDNA第二链的合成:
a. 用反转录酶,例如RT M-MuLV反转录酶(YT392)、RT M-MuLV反转录酶(RNase H-)(YT393)或cDNA 第一链合成试剂盒(RNase H-)(YT395)合成cDNA第一条链,70℃孵育10分钟终止反应。
b. 在冰浴上向已经合成第一条链的20µl反应体系中依次加入如下试剂:
Reaction Buffer (10X) for DNA Polymerase I————8µl
无核酸酶去离子水—————————————————68.8µl
RNase H (5U/µl)—————————————————0.2µl
DNA Polymerase I, E.coli—————————————3µl (30U)
c. 按上述体系配好之后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
d. 15℃孵育2小时。(注意:反应温度不能超过15℃)
e. 加入5µl 0.5M EDTA(pH 8.0)混匀,以终止反应。
f. 后续可以使用酚氯*(代"仿")抽提、乙醇沉淀等方法纯化合成的双链cDNA,也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(YT009)可以向订购。
注:Reaction Buffer (10X) for DNA Polymerase I:500mM Tris-HCl(pH 7.5 at 25℃),100mM MgCl2,10mM DTT。