RNase H

RNase H

规格：100U
英文名：Ribonuclease H
本酶是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。RNase H不能水解单链或双链DNA或RNA中的磷酸二酯键，即不能消化单链或双链DNA或RNA。

特点：特异性消化DNA-RNA杂合链中的RNA，常用于cDNA第二链的合成。
用途：DNA-RNA杂合链中去除RNA，例如cDNA第二条链合成前去除mRNA；通过互补的DNA序列实现对RNA的定点剪切；除去杂交到poly(dT)上的mRNA中的poly(A)；体外多腺苷酸化反应(polyadenylation reaction)产物研究。
来源：E.coli MRE-600细胞。
分子量：约18.4kDa(单体)。
活性定义：37℃20分钟内，能够催化1nmol杂合双链中的RNA形成酸可溶性核糖核苷酸形式所需的酶量定义为1个活性单位。
活性检测条件：20mM Tris-HCl(pH7.8)，40mM KCl，8mM MgCl2，1mM DTT，24μM[3H]-poly(A).poly(dT)，0.03mg/ml BSA ，4%(v/v)glycerol。
纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含其它核糖核酸酶。
酶储存溶液：25mM HEPES-KOH(pH8.0)，50mM KCl，1mM DTT，1mM EDTA，0.1mg/ml BSA，50%(v/v)glycerol。
Reaction Buffer(10X)：200mM Tris-HCl(pH7.8)，400mM KCl，80mM MgCl2，10mM DTT。
失活或抑制：65℃加热10分钟可使RNase H失活。金属离子螯合剂和巯基封闭剂均能抑制RNase H活性。
储存条件：-20℃。

使用说明：

1. DNA-RNA杂合链中去除RNA：
a. 用反转录酶，例如RT M-MuLV反转录酶或RT M-MuLV反转录酶(RNase H-)合成cDNA第一条链，70℃孵育10分钟终止反应。
b. 在冰浴上向已经合成第一条链的20µl反应体系中依次加入如下试剂：
Reaction Buffer (10X)————2µl
无核酸酶去离子水——————217.8µl
RNase H (5U/µl)——————20.2µl
c. 按上述体系配好之后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
d. 37℃孵育1小时。
e. 加入2.5µl 0.5M EDTA(pH8.0)混匀，以终止反应。
f. 后续可以使用酚氯*(代"仿")抽提、乙醇沉淀等方法纯化合成的双链cDNA，也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(YT009)可以向订购。
说明：其他情况DNA-RNA杂合链中去除RNA的条件可以参考上述条件进行。RNase H反应的pH范围约在7.5-8.3均可。

2. 杂合链中RNA的去除和cDNA第二链的合成：
a. 用反转录酶，例如RT M-MuLV反转录酶(YT392)、RT M-MuLV反转录酶(RNase H-)(YT393)或cDNA 第一链合成试剂盒(RNase H-)(YT395)合成cDNA第一条链，70℃孵育10分钟终止反应。
b. 在冰浴上向已经合成第一条链的20µl反应体系中依次加入如下试剂：
Reaction Buffer (10X) for DNA Polymerase I————8µl
无核酸酶去离子水—————————————————68.8µl
RNase H (5U/µl)—————————————————0.2µl
DNA Polymerase I, E.coli—————————————3µl (30U)
c. 按上述体系配好之后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
d. 15℃孵育2小时。(注意：反应温度不能超过15℃)
e. 加入5µl 0.5M EDTA(pH 8.0)混匀，以终止反应。
f. 后续可以使用酚氯*(代"仿")抽提、乙醇沉淀等方法纯化合成的双链cDNA，也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(YT009)可以向订购。
注：Reaction Buffer (10X) for DNA Polymerase I：500mM Tris-HCl(pH 7.5 at 25℃)，100mM MgCl2，10mM DTT。

3. 其他用途请参考上述用途或相关文献资料进行。