己烯雌酚检测试剂盒

己烯雌酚快速检测试剂盒说明书

一、原理

本试剂盒采用间接竞争 ELISA 方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物己烯雌酚将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗己烯雌酚抗体，加入酶标记物后，用 TMB 底物显色，样本吸光值与其所含残留物己烯雌酚的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物己烯雌酚的含量。

二、试剂盒特性

u试剂盒灵敏度： 0.1ppb

u 孵育温度： 37℃
u 孵育时间： 30min～30min～15min
u 样本检测下限

组织（虾、鱼） ······························· 0.2 ppb
猪肉/肝 鸡肉/肝 ······························· 2 ppb
肌肉组织(方法二) ··························· 0.1 ppb
饲 料 ············································ 20ppb
尿 液 ··········································· 0.6ppb
u 交叉反应率
己烯雌酚 ········································ 100%
双烯雌酚 ········································ 38.5%
己烷雌酚 ········································ 8.5%
己炔雌二醇 ··································· ﹤0.1%
雌三醇 ········································· ﹤0.1%

u样本回收率

饲 料 ·········································· 90±10%
组 织 ·········································· 85±10%
尿 液 ·········································· 70±10%
三、试剂盒组成

1 微量测试孔 每条 8 孔，一板 12 条



标准液×6 瓶 0ppb 0.1ppb
2 0.3ppb 0.9ppb
（1ml/瓶）
2.7ppb 8.1ppb


3 酶标记物 12ml 红色帽

4 抗体工作液 7ml 蓝色帽

5 底物 A 液 7ml 白色帽

6 底物 B 液 7ml 黑色帽

7 终止液 7ml 黄色帽

8 20X 浓缩洗涤液 40ml 白色帽

9 5X 浓缩复溶液 50ml 透明帽


四、所用仪器、试剂

具备的仪器：酶标仪、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹仪、恒温箱

微量移液器：单道 20～200µl、单道 100～1000µl、

多道 30～300 µl

试 剂：乙、氢氧化钠、氯仿、丙酮、浓磷

酸（含量 85%）、乙酸乙酯

五、样本前处理步骤

u样本处理前须知

（a）实验中必须使用一次性吸头，吸取不同试剂时要更换吸头。

（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。
u 样本前处理需配制：

配液 1 6M H3PO4 溶液

100ml 浓 H3PO4（含量 85%）加去离子

水 150ml 混合均匀。

配液 2 2M NaOH 溶液

8gNaOH 加去离子水 100ml 溶解。

配液 3 1M NaOH 溶液

4gNaOH 加去离子水 100ml 溶解。

配液 4 乙-丙酮混合液


V 乙-V 丙酮 = 4 : 1

配液 5 样本复溶液：

将5X 浓缩复溶液用去离子水 1：4 稀释。

u样本处理：

（a）组织（鸡、鸭、猪肉/猪肝、虾、鱼)处理方法

1、称取 2±0.05g 匀浆后的样本，加入 6ml 乙-丙

酮混合液，震荡 2min，15℃，4000r/min 以上，离心 10min。

2、取 3ml 上清液，60℃氮气/空气吹干。

3、加入 0.5ml 氯仿，涡动 20s，加入 2ml 2M NaOH，

涡动 30s，4000r/min 以上，离心 5min。

4、取 1ml 上清液，加入 200µl 6M H3PO4，涡动 5s。5、加入 3ml 乙萃取，振荡 2min，室温 4000r/min

以上，离心 10min，取上层有机相， 60℃氮气/空气吹干。

6、用 1ml 样本复溶液溶解干燥的残留物，混匀

30s。

不同样本按如下方法稀释：

1、 虾鱼：直接取 50µl 水相用于检测。

2、 猪肉/肝、鸡肉/肝：取 50µl 水相加入 450µl 样

本复溶液，涡动混合 30s；取 50µl 用于检测。

样本的稀释倍数：虾鱼稀释倍数：2

猪肉/肝、鸡肉/肝稀释倍数：20

（b）肌肉组织处理方法二

1、称取 2±0.05g 匀浆后的样本，加入 2ml 2M

NaOH 溶液，震荡 2min；2、加入 8ml 乙酸乙酯，剧烈震荡 5min ；

3、 15℃，4000r/min 以上，离心 10min；

4、取 4ml 上层有机相， 60℃氮气/空气吹干；

5、用 1ml 样本复溶液溶解干燥的残留物，混匀

30s。

样本稀释倍数：1

（c）饲料处理方法

1、称取 2±0.05g 捣粹后的饲料样本，加入 8ml 乙

，振摇 2min，15℃ 4000r/min 以上离心 10min；2、取 2ml 上清液，60℃氮气/空气吹干；

3、加入 0.5ml 氯仿，涡动 20s，加入 2ml 1M NaOH，


涡动 30s，4000r/min 以上，离心 5min；4、取 1ml 上清液，加入 100µl 6M H3PO4，涡动 5s；

不同样本按如下方法稀释：

1、 配合料：取 50µl，加入 950µl 样本复溶液，涡

动混匀 30s，取 50µl 用于检测。

2、 浓缩料/预混料：取 25µl，加入 975µl 样本复溶液，涡动混匀 30s，取 50µl 用于检测。
样本稀释倍数：

配合料稀释倍数：100

浓缩料、预混料稀释倍数：200

（d） 尿样样本处理方法

1、取 2ml 尿液到离心管中，室温 4000r/min 以上，

离心 10min，直至清亮；2、移取 1ml 清亮尿液至离心管中，加入 1ml 1M

NaOH 强烈振荡 5min；3、加入 100µl 6M H3PO4，涡动 30 s；

4、再加入 8ml 氯仿进行萃取，振荡 5min。15℃，

4000r/min 以上离心 10min；

5、去掉上层的水相，取下层有机相 4 ml，60℃氮

气/空气吹干；6、用 3ml 样本复溶液干燥的残留物，混合 30s 7、取 50µl 用于分析。

样本稀释倍数：6

六、酶标免疫分析程序:

u测定前应须知：

1、 使用前将需用试剂和板条的温度回升至室温

（20～25℃）。

2、 使用之后立即将所有试剂放回 2～8℃。

3、 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是 ELISA 测定程序中的要点。

4、 所有恒温孵育过程，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。

u操作步骤：

1、从 2～8℃冷藏环境中取出所需试剂，室温（20～

25℃）平衡 30min 以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放


入自封袋，保存于 2-8℃。

3、配液：将 40ml 浓缩洗涤液（20 倍浓缩）用去离子水按照 1：19 稀释（1 份浓缩洗涤液+19 份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。

4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做 2 孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、加标准品/样本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加加入抗体工作液 50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀。37℃环境中反应 30min。

6、将孔内液体甩干，用已稀释的洗涤液 250µl/孔洗板 4～5 次，每次间隔 15～30 秒，用吸水纸拍干（拍干后未清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

7、每孔加入酶标记物 100µl，盖板膜盖板后置37℃环境中反应 30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗，4～5 遍（同上），用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

8、显色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B

液 50µl/孔，轻轻振荡混匀，37℃环境中避光显色 15min。

9、测定：加入终止液 50µl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm 处（建议用双波长 450/630n m 检测，5min 内读数），测定每孔 OD 值。

七、结果判定

结果判定有两种方法，粗略判定可用第 1 种方法，定量判定用第 2 种方法。注意样本吸光度值与其所含己烯雌酚量成负相关。

1、粗略判定：

用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本 1 的吸光度值为 0.3，样本 2 的吸光度值为 1.0，标准液吸光度值分别是：

0ppb 为 2.243； 0.1ppb 为 1.816；0.3ppb 为 1.415； 0.9ppb 为 0.74；2.7ppb 为 0.313；8.1ppb 为 0.155。

则样本 1 的浓度范围是 2.7ppb～8.1ppb；样本 2 的浓度范围是 0.3ppb～0.9ppb，乘以其对应的稀释倍数即为样本中己烯雌酚实际浓度。

2、定量分析
（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分 2、保 质 期：该产品有效期为 1 年，生产日期见
吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双 包装盒。
孔）除以第一个标准（0 标准）的吸光度值，再乘 提示：酶标板真空包装袋若有漏气，酶标板仍然正
以 100%，即 常有效，不影响实验结果，请放心使用。
B
百分吸光率（%）＝ ×100%
B0


B
—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以己烯雌酚标
准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数 即为样本中己烯雌酚实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

八、 注意事项

1、室温低于 25℃或试剂及标本未回到室温（20～

25℃）会导致所有标准的 OD 值偏低。

2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、反应终止液为 2M 硫酸，避免接触皮肤。

5、不要使用过了有效日期的试剂盒；稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD 值变化；不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。标准品 1 的吸光度值小于 0.5 时，表示试剂可能变质。

8、该试剂盒最佳反应温度为 37℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

九、储藏条件和保质期

1、储藏条件：试剂盒于 2-8℃保存，不要冷冻。