孔雀石绿检测试剂盒

孔雀石绿快速检测试剂盒说明书

一、原理

本试剂盒采用间接竞争 ELISA 方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物孔雀石绿将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗孔雀石绿抗体，加入酶标记物后，用 TMB 底物显色，样本吸光值与其所含残留物孔雀石绿的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物孔雀石绿的含量。

二、试剂盒特性

u试剂盒灵敏度： 0.05ppb

u 孵育温度： 25℃

u 孵育时间： 30min～30min～15min

u样本检测限

水样 ······································· 0.1ppb

水产品 ······································· 0.5ppb

u交叉反应率

显性孔雀石绿 ································· 100%
隐性孔雀石绿 ································ 0.1%
结 晶 紫 ···································· 95%
隐性结晶紫 ·································· 0.1%

u样本回收率

水样、水产品 ···························· 80%~110%

u精密度

板内、板间变异系数≤12%

三、试剂盒组成

1 微量测试孔 每条 8 孔，一板 12 条

10 倍浓缩标准液 0ppb 0.5ppb
×6 瓶
2 1.5ppb 4.5ppb
（1ml/瓶、黑色帽）
13.5ppb 40.5ppb

3 酶标记物 12ml 红色帽

4 抗体工作液 7ml 蓝色帽



5 底物 A 液 7ml 白色帽

6 底物 B 液 7ml 黑色帽

7 终止液 7ml 黄色帽

8 20X 浓缩洗涤液 40ml 白色帽

9 氧化剂 3ml 白色帽

10 4X 浓缩复溶液 50ml 透明帽


四、所用仪器、试剂

具备的仪器：酶标仪、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹仪、恒温箱

微量移液器：单道 20～200µl、单道 100～1000µl、

多道 30～300 µl

试 剂：、二氯甲烷、无水硫酸钠、正己

烷

五、样本前处理步骤

u样本处理前须知

（a）实验中必须使用一次性吸头，吸取不同试剂时要更换吸头。

（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。
u 样本前处理需配制：

配液 1 样品提取液-二氯甲烷混合溶液：

V -V 二氯甲烷 = 4 : 1，取 40ml ，

再加入 10ml 二氯甲烷，混匀后使用。

配液 2 样品复溶液

将 4X 浓缩复溶液用去离子水按 1：3 稀释（1 份 4×浓缩复溶液+3 份去离子水），或按所需用量配制。

u 样本处理：（a）水样处理方法
取 50µl 清澈水样样直接测定（如果水样浑浊一定要过滤或 4000r/min 离心 10min，直至得到清澈样），暂不使用的样本应冷冻保存。

样本稀释倍数: 1 倍


（b）水产品处理方法

1、称取 2±0.05g 均质组织样品于 50ml 离心管中，加入 6ml 样品提取液（配液 1），2g 无水硫酸钠，振荡 5min ，室温（25℃左右）4000r/min

以上离心 10min；2、取 3ml 上清液，加入 20µl 氧化剂，摇匀，在 56℃

条件下氮气或空气流吹至完全干燥；3、加入 1ml 正己烷，加入 1ml 样品复溶液（配液

2），振荡摇匀 1min，4000r/min 以上离心 5min；

4、取下层 50 µl 用于分析；

样本稀释倍数: 1 倍

注：此方法所得到的结果为孔雀石绿；隐性孔雀石绿；结晶紫；隐性结晶紫的总量。

六、酶标免疫分析程序:

u测定前应须知：

1、 使用前将需用试剂和板条的温度回升至室温

（20～25℃）。

2、 使用之后立即将所有试剂放回 2～8℃。

3、 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是 ELISA 测定程序中的要点。

4、 所有恒温孵育过程，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。
u操作步骤：

1、从 2～8℃冷藏环境中取出所需试剂，室温（20～

25℃）平衡 30min 以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放

入自封袋，保存于 2-8℃。

3、配液 1：将 40ml 浓缩洗涤液（20 倍浓缩）用去离子水按照 1：19 稀释（1 份浓缩洗涤液+19 份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。
配液 2：

配制孔雀石绿标准液：取一定量的 10 倍浓缩标准液用样品复溶液 10 倍稀释，现配现用，具体如下：

标准液6：配制4.05ppb 标准液--取50ul 40.5ppb

标准液加 450ul 样品复溶液混匀；


标准液5：配制1.35ppb 标准液--取50ul 13.5ppb

标准液加 450ul 样品复溶液混匀；

标准液 4：配制 0.45ppb 标准液--取 50ul 4.5ppb

标准液加 450ul 样品复溶液混匀；

标准液 3：配制 0.15ppb 标准液--取 50ul 1.5ppb

标准液加 450ul 样品复溶液混匀；

标准液 2：配制 0.05ppb 标准液--取 50ul 0.5ppb

标准液加 450ul 样品复溶液混匀；

标准液 1：配制 0ppb 标准液--取 50ul 0ppb 标

准液加 450ul 样品复溶液混匀；4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每

个样本和标准品做 2 孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、加标准品/样本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加入抗体工作液 50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀。25℃环境中反应 30min。

6、将孔内液体甩干，用已稀释的洗涤液 250µl/孔洗板 4～5 次，每次间隔 15～30 秒，用吸水纸拍干（拍干后未清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

7、每孔加入酶标记物 100µl，盖板膜盖板后置25℃环境中反应 30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗，4～5 遍（同上），用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

8、显色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B 液 50µl/孔，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色 15min。

9、测定：加入终止液 50µl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm 处（建议用双波长 450/630n m 检测，5min 内读数），测定每孔 OD 值。

七、结果判定

结果判定有两种方法，粗略判定可用第 1 种方法，定量判定用第 2 种方法。注意样本吸光度值与其所含孔雀石绿量成负相关。

1、粗略判定：用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本 1 的吸光度值为 0.3，样本 2 的吸光度值为 1.0，标准液吸光度值分别是：



0ppb 为 2.243；0.05ppb 为 1.816；0.15ppb 为 1.415； 变质。
0.45ppb 为 0.74；1.35ppb 为 0.313；4.05ppb 为 0.155。 8、该试剂盒最佳反应温度为 25℃，温度过高或过
则样本 1 的浓度范围是 1.35ppb～4.05ppb；样本 2 低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
的浓度范围是 0.15ppb～0.45ppb，乘以其对应的稀 九、储藏条件和保质期

释倍数即为样本中孔雀石绿实际浓度。 1、储藏条件：试剂盒于 2-8℃保存，不要冷冻。
2、定量分析
2、保 质 期：该产品有效期为 1 年，生产日期见
（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分
包装盒。

吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双 提示：酶标板真空包装袋若有漏气，酶标板仍然正

孔）除以第一个标准（0 标准）的吸光度值，再乘 常有效，不影响实验结果，请放心使用。

以 100%，即
B
百分吸光率（%）＝ ×100%
B0

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以孔雀石绿标

准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中孔雀石绿实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

八、 注意事项

1、室温低于 25℃或试剂及标本未回到室温（20～

25℃）会导致所有标准的 OD 值偏低。

2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、反应终止液为 2M 硫酸，避免接触皮肤。

5、不要使用过了有效日期的试剂盒；稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD 值变化；不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。标准品 1 的吸光度值小于 0.5 时，表示试剂可能