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赫澎(上海)生物
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文献和实验SYBR Green Quantitative PCR Protocol
12μl of master mix for each well, plus some excess1 Rxn: 10μl SYBR Green Mix 52 Rxn: 520μl SYBR 0.4μl Forward Primer (10μM stock) 20.8μl F
步法能够实现包括低丰度RNA 在内的RNA 的定量. 选择Tm 值尽可能小的引物,使PDs 与扩增产物Tm 值之间有足够的差距,将更有利于四步法的应用,并可成功地用于低丰度RNA 的准确定量. 关键词 引物二聚体,荧光实时定量RT-PCR ,SYBR green Ⅰ,四步法,RNA 定量 Elimination of Primer2dimer Effect in SYBR Green Ⅰ Real-time RT-PCR Using 42step Program
引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果,建议使用15nt的随机引物2. oligo-dT:只能用于mRNA完整的样品,特别有polyA .而且对于一些特殊的变异体以及较长的3’UTR的区域比较困难3. 特异引物:最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。PCR 优化PCR优化主要有:1. 引物的浓度2. 建议使用SYBR Green I和EvaGreen 进行扩增和溶解曲线的测试笔者建议的操作流程I.靶的选择和试验设计1. 针对目的基因序列选择合适的扩增片断查看以下三个网站是否
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