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- KALANG
- 中国大陆
- KL005
- 2025年07月16日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
2～8℃
- 保质期：
长期
- 库存：
大量
- 供应商：
康朗生物
- 规格：
20次/50次
胚乳组织及丝状真菌超纯RNA快速提取试剂盒
编号：KL005规格：20次/50次
适用范围：
适用于从胚乳组织和丝状真菌材料中提取无基因组DNA污染的高纯度的总RNA。
本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项：
1.所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
2.不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍：
独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，植物RNA助提剂PLANTaid帮助结合多糖多酚并通过离心去除，然后用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从玻璃纤维膜上洗脱。
产品特点：
1.离心吸附柱内玻璃纤维膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.不需要使用有毒的苯酚，等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
3.快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。
4.独有的植物RNA助提剂可以有效结合多糖多酚,提高清除效果。
5.基因组DNA清除柱可以有效的消除基因组DNA的污染。
6.多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留,可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。
注意事项
1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到12,000 rpm的传统台式离心机。
2.需要自备乙醇， β-巯基乙醇，一次性注射器（可选），研钵。
3.裂解液RLCplus2 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4.RNA 纯度及浓度检测:
完整性： RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA，电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb，分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯 度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。
浓 度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40
操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
提示：
第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量无水乙醇!
操作前在裂解液RLCplus2中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml RLCplus2中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLCplus2 4℃可放置一个月。
1.直接研磨法（推荐）:
a. 新鲜胚乳组织或丝状真菌称重后取100mg迅速剪成小块放入研钵（冰冻保存或者液氮保存样品可直接称重后取100mg放入研钵）， 加入10体积（1ml）RLCplus2(请确定已加入β-巯基乙醇)和1体积（100μl） PLANTaid 室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液RLCplus2立刻充分接触以抑制RNA酶活性。
b. 将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡15秒，12，000rpm离心5-10分钟，沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid，将所有裂解物上清转移至一个基因组DNA清除柱中（清除柱放入收集管中），12,000rpm离心30~60秒，收集滤液。接下步骤3
2.液氮研磨法:
a.取500μl裂解液RLCplus2(已经加入β-巯基乙醇)，转入1.5ml离心管中，加入50μl PLANTaid混匀备用。
b.液氮中研磨适量胚乳组织或丝状真菌成细粉后，取50mg细粉转入上述装有RLCplus2和PLANTaid的离心管, 立即用手剧烈振荡20秒，充分裂解。
c.用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9mm针头) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。
d.将裂解物12，000rpm离心5-10分钟,沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid, 将所有裂解物上清转移至一个基因组DNA清除柱中（清除柱放入收集管中），12,000rpm离心30~60秒，收集滤液。接下步骤3
3.较精确估计所收集的滤液体积，加入0.5体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。将混合物(每次小于700μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm离心60秒，弃掉废液。
4.向吸附柱RA中加500μl 去蛋白液RW1，室温放置30秒，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。
5.向吸附柱RA中加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW,重复一遍。
6.将吸附柱RA放回空收集管中，12,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
7.取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加热效果更好）， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。
8.如果预期RNA产量>30μg,加30-50μl RNase free water重复步骤7, 合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。
附录：DNase I柱上消化
一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留,本公司的EASYspin系列RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，避免了大部分的DNA残留，此外，本试剂盒中配备的基因组DNA清除柱也可以有效的消除基因组DNA的污染。然而，由于材料的差异，某些材料也许基因组残留会非常明显，或者加入的裂解液和材料的起始量没有很好比例时，即使通过基因组DNA清除柱也会有没有完全消除掉基因组DNA的污染的情况，尽管在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染色不可见）影响不是很大, 如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR,此时可用RNase free DNaseI直接在离心吸附柱子RA上面消化DNA，然后纯净RNA可以洗脱下来直接使用。
DNase I 工作液的配制：
取10x DNase I buffer 8μl ，加入 DNAse I 3μl（15U），RNAse 抑制剂10U(可加可不加，建议加)，无核酸酶水补足至80μl，轻柔混匀。
DNase I柱上消化操作步骤：
1．前面按照正常步骤操作，在操作步骤4加入去蛋白液RW1步骤前按照以下步骤操作。
2．向吸附柱RA 中加入350 μl 去蛋白液RW1，12,000 rpm 离心30-60 秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
3．向吸附柱RA 中央加入80μl 的DNase I 工作液，室温放置15 分钟。
4．向吸附柱RA 中加入350 μl 去蛋白液RW1， 12,000 rpm 离心30-60 秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
5．接操作步骤5中加入漂洗液RW步骤等后续步骤。
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文献和实验相关实验
。3. 裂解液RLT 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。4. 植物组织裂解是否充分直接影响到RNA 提取的质量和产量，本试剂盒中提供的裂解液RLT，主要成分为异硫氰酸胍，适用于大多数植物组织的裂解，但有些植物组织（例如玉米的乳白色胚乳）或丝状真菌，由于次级代谢产物较特殊，异硫氰酸胍使样品产生固化，导致RNA 无法提取，此时可以向我们索取另一种裂解液RLC，将解决该问题。5. 关于DNA 的微量残留:一般说来
是TRIpure（RN01）加氯仿，异丙醇，70%乙醇，DEPC处理的水。(3) RN03 RNApure 超纯总RNA快速提取试剂盒。这个等于是TRIzol加离心柱子，在TRIzol的基础上加了离心柱子，速度更快，纯度更高，操作更简单。等于是TRIpure（RN01）加离心柱子。(4) RN07 EASYspin组织/细胞RNA快速提取试剂盒。这款等于是Qiagen的74104完全一样，它的优点在于不用苯酚，氯仿等毒性物质，速度最快，但是残留DNA可能稍多，必要时候还可能要用DNA
Plus 组织/细胞RNA快速提取试剂盒 由北京艾德莱生物研发部推出。这是在RN07 EASYspin组织/细胞RNA快速提取试剂盒无苯酚、氯仿RNA快速提取技术基础上又研发成功出基因组DNA清除柱技术，确保有效清除gDNA残留，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于PCR、荧光定量PCR等实验。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，然后裂解混合物通过一个基因组DNA清除柱，基因组DNA被清除而RNA穿透滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅
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