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- 2025年12月23日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
大量
- 供应商：
深圳市科润达生物工程有限公司
- 检测范围：
科研
- 检测方法：
ELISA
- 应用：
用于血清，血浆和尿液中人可溶性α–klotho的定量检测
- 适应物种：
人
- 标记物：
α–klotho
- 样本：
血清/血浆/尿液
- 规格：
96T
（日本IBL 27998）
α–klotho被定义为极端的下调基因，它在转基因小鼠（klotho小鼠）的表现类似于人类衰老的各种症状，α–klotho基因的序列已在多个物种中得到确定，包括人类（基于转基因小鼠），α–klotho蛋白是分子量为130kDa的横跨膜蛋白，并在肾脏和甲状旁腺内表达。
近年来，已证实α–klotho是生物体内矿物质代谢的重要分子，如钙和磷的代谢。因此，有人认为，klotho小鼠的早期老化症状就是因α–klotho的表达减少导致矿物质稳态破坏而引起，与此同时，有报道称，组成α–klotho蛋白序列的主要部分：长N-端胞外域，因脱落释放至血液中。然而对于可溶性α–klotho蛋白的功能和浓度的变化仍存在很多疑问，所以要求研发一套α–klotho的检测系统
此ELISA试剂盒就可以检测人血液中的α–klotho蛋白。
实验原理
此试剂盒根据酶免法的夹心原理，利用两种不同的高特异性抗体，TMB作为着色剂，颜色强度与人可溶性α–klotho的量成正比
检测范围
93.75~6000pg/mL
预期用途
此试剂盒可用于血清，血浆和尿液中人可溶性α–klotho的定量检测
试剂盒组成
- 包被板，96孔，包被有抗人可溶性α–klotho（67G3）小鼠IgG单抗，亲和纯化
- 标记抗体浓缩，30X，0.4mlx1，HRP标记的抗人可溶性α–klotho小鼠IgG Fab’，亲和纯化
- 标准品，0.5mlx2，重组人可溶性α–klotho
- EIA缓冲液，30mlx1
- 标记抗体稀释液，12mlx1,1%BSA，含0.05%吐温20的PBS
- 着色剂，15mlx1，TMB底物液
- 终止液，12mlx1，1N硫酸
- 洗涤缓冲浓缩液，50mlx1, 40X，含0.05%吐温20的磷酸缓冲液
- 酶标仪（450nm）
- 移液器和枪头
- 烧杯
- 蒸馏水
- 孵箱（37±1℃）
- 坐标纸（对数-对数）
- 吸水纸
- 标准品稀释管
- 洗瓶
- 一次性试验管
- 洗涤缓冲液制备：先将洗涤浓缩液平衡至室温，充分混匀，然后吸取50ml浓缩液与1950ml的去离子水混匀，即得。配制的洗涤液应保存于冰箱内，并于2周内用完
- 标记抗体的制备：用标记抗体稀释液将标记抗体稀释30倍，即得。
此步骤在实验前完成
剩余的标记抗体浓缩应装于密封瓶内，保存在4℃
- 标准品的制备：吸取0.5ml的去离子水至标准品瓶内，充分混匀，得到12000pg/ml的人可溶性α–klotho标准品
- 标准品的稀释：准备8个试管用于标准品的稀释，每管加入230ul的EIA缓冲液
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结果计算
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特别注意
- 试验样品采集后应立即检测或是冻存，冻存的样品避免反复冻融，检测前应在低温下先将其完全溶解混匀
- 试验样品用EIA缓冲液稀释
- 试验样品和标准品应做双份检测
- 试验样品应在中性PH范围，有机溶剂的污染可能会影响检测
- 只能用试剂盒提供的洗涤液洗板，否则会导致试验失败
- 吸水纸上拍干微孔板，不能擦拭
- TMB底物液应贮存于黑暗处，因其对光敏感，且避免接触金属
- 加入终止液后30min内必须酶标仪读数
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文献和实验人 1-118 44c a. Korf等和Kohl等的研究中包含了六组氨酸标签。 b. 可溶性蛋白量大于等于10%即认为该融合蛋白可溶。 c. 纯化后的融合蛋白如果在SDS-PAGE后考染在合适位置出现条带即认为可溶。 Korf等的还发现对于定位于真核细胞细胞器，质膜或者骨架的蛋白，相对于其它标签系统来讲，NusA标签是最好的可溶性表达
，其显色效果比单独使用酚试剂强3-15倍，约是双缩脲法的100倍。由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。LoWry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理（如加入少量的SDS）。1.双缩脲法的原理双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成
与可溶性蛋白抗原反应的特异性Th克隆的制备需体内致敏，以及需要同系脾细胞作为抗原提呈细胞。有两种类型的辅助T细胞，即分泌IL-2的Th1和分泌IL-4的Th2，前者在克隆时需加入IFN-γ。 材料和试剂： 1. 免疫用动物； 2. 蛋白抗原和完全福氏佐剂（CFA）； 3. 完全RPMI-1640培养液； 4. 生长因子的来源：可用ConA刺激上清或MLC培养上清，另外亦可用重组淋巴因子作为IL-2和IFN-γ的来源； 5. 动物
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