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细胞共培养/趋化/迁移/侵袭/
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细胞功能实验服务
上海锐赛
共培养/趋化/迁移/侵袭检测
Transwell Detection
实验原理
细胞迁移是指细胞在接收到内源或外源迁移信号后而产生的移动。细胞迁移是通过胞体形变进行的缓慢的定向移动,涉及细胞觅食、伤口痊愈、胚胎发生、免疫反应、感染和癌症转移等生理现象。因此通过对细胞迁移的研究,对阻止癌症转移、异体植皮等医学应用方面具有一定意义。细胞侵袭实验则是研究肿瘤细胞对基质膜消化后的迁移运动,肿瘤细胞须经血管基底膜穿入深面间质后才能侵袭组织和转移至远处。
实验流程
实验结果展示
图1 Transwell细胞迁移实验结晶紫染色结果及柱形图分析
流式凋亡检测
Apoptosis Detection
细胞凋亡(Cell apoptosis)是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡不是一件被动的过程,而是主动过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用,它并不是病理条件下的损伤,而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。 细胞凋亡检测的方法很多,我们采用的Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡的原理:磷脂酰丝氨酸(Phosphatidyl serine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行EGFP融合、荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针。
图1 采用流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡
碘化丙啶(Propidine lodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但可进入凋亡中晚期的细胞和死细胞,而使细胞核红染。Annexin V/PI 双染法检测细胞凋亡,可以将凋亡早期的细胞和凋亡晚期以及死细胞区分开。
技术应用
细胞凋亡研究不仅受到基础医学界的重视,也日益受到临床医学领域的青睐。通过检测药物、基因或蛋白对细胞凋亡及凋亡调控基因的影响,在肿瘤防治、老年痴呆、艾滋病、自身免疫病,心肌梗塞等研究上都发挥着积极的作用。
TROUBLESHOOTING
常见问题FAQ
Q :常用的细胞凋亡的检测种类有哪些?A :凋亡检测方法有数十种之多,主要可以分为以下几大类: 1) DNA水平,检测凋亡时基因组DNA的变化; 2)蛋白水平,主要检测凋亡时线粒体和死亡受体两大凋亡通路的变化; 3)细胞膜/细胞器膜水平,主要检测凋亡时细胞膜成分或者膜电位的变化; 4)超微结构,主要检测凋亡时亚细胞结构的变化。这些方法各有优缺点,必须结合具体的实验目的,实验条件以及实验处理来选择合适的分析手段。
Q :常见的细胞凋亡检测方法及优缺点比较?
Anexin VPI双染法:
Annexin v可结合凋亡细胞外翻的PS
蛋白。
Sub G1 峰检测:
凋亡细胞DNA含量的流式细胞计划分析,分析DBA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。
TUNRL法:
染色体DNA双链断裂或单链断裂而产
生大量的粘性3‘ -OH末端,可在脱氧
核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用
下,对DNA的3’ 末端进行荧光剂标记。
Q: Annexin V/PI双染实验的四个象限分别代表什么?
A:根据费光情况划分四个象限(见图7.6) ,横坐标代表绿色荧光(Annexin V为FITC绿色荧光标记),纵坐标代表Pl红色荧光,四个象限分别命名为LL, LR, UR, UL,由于Pl不能穿过未凋亡细胞和凋亡早期细胞的细胞膜,而Annexin V可以检测到凋亡早期外翻的PS,因此四个象限代表了不同的细胞群。
图7.6流式四象限图
Q:流式上机检测细胞凋亡每次所需要的细胞量大概是多少?A:靶细胞接种到6孔板中进行前期药物处理/转染/感染后备用。对于个体比较大的细胞,依据实际细胞密度,使用150pxt培养血培养细胞,最终进行检测需要10^5-10^6个细胞。
参考文献
1. Vermes I, C, Steffens-Nakken H,et al. A novel assay for apoptosis. FIow cytometric detection ofphosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J Immunol Methods 1995,184(1):39-51.
2. K o o pman G, Reutelingsperger CP, Kuijten GA, et al . Annexin V for flow cytometric of phosphatidylserineexpression on B cells undergoing apoptosis. BIood 1994, 84(5):1415-1420.
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