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文献和实验Using Phospho‐Motif Antibodies to Determine Kinase Substrates
the phosphorylation site; therefore, substrate?directed, phosphorylation?state?sensitive, motif?specific (?phospho?motif?) antibodies represent powerful tools to identify novel kinase substrates and to investigate mechanisms of substrate phosphorylation
网络 第二节 蛋白酪氨酸激酶 蛋白酷氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK）是一类催化ATP上γ-磷酸转移到蛋白酪氨酸残基上的激酶，能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化，在细胞生长、增殖、分化中具有重要作用。迄今发现的蛋白酪氨酸激酶中多数是属于致癌RNA病毒的癌基因产物，也可由脊椎动物的原癌基因产。根据PTK是否存在于细胞膜受体
活性激酶：纯化重组蛋白，或经IP富集后保留活性的激酶； · 候选底物：纯化全长蛋白、蛋白片段或合成肽段； · ATP和Kinase Buffer：提供磷酸基团及Mg²⁺等激酶反应所需环境； · 磷酸化检测体系：磷酸化位点抗体、泛p-Ser/Thr/p-Tyr抗体、放射性ATP、Phos-tag或质谱等。 正式实验前先确认重组蛋白纯度和浓度。激酶还要关注活性状态，底物则尽量使用结构完整、可溶性好的蛋白。 如果已经预测出具体磷酸化位点，可以同步准备WT底物和磷酸化位点突变体，例如Ser/Thr常做
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