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原代细胞培养
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原代细胞培养实验服务
晶莱生物
组
(一)原理从供体获取组织细胞的首次培养叫原代细胞培养或初代细胞培养(primary culture)。原代细胞离体时间短,具有二倍体遗传性,在一定程度上能反映体内生长特性,很适合作药物测试、细胞分化和转化等实验研究。在临床应用中,短期原代培养细胞的移植疗效明显高于未经培养的组织细胞。故体外培养的人体各部位细胞,尤其是上皮细胞对于研究各种疾病的发生、发展及防治都具有重要意义。根据不同的实验目的,不同的实验材料,解离或分离细胞的方法和条件各有不同。一般常用方法有二:一是组织块培养法,二是单层细胞培养法。本实验采用胰蛋白酶消化法,对初生乳鼠肺组织进行原代培养。(二)实验用品1. 材料:新生乳鼠。2. 器材:眼科剪、眼科镊、泡器械(直径 15cm )培养皿、动物解剖用的泡沫支架、青霉素瓶、吸管、培养瓶、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、电磁搅拌器。3. 试剂:Hank’s液、RPMI-1640液、血清细胞培养液、安尔碘、酒精。(三)无菌操作基本要领和要求1.操作准备把实验用品放置于超净台内,打开紫外线杀菌灯和超静台风机,30分钟后关闭紫外线灯。由于紫外线消毒时产生臭氧,对身体有害,故紫外线消毒停止后30分钟才可入室工作。实验溶液恢复至室温后使用,培养细胞和培养用液等避免紫外线照射。2.洗手:双手经洗手、泡手、酒精消毒,原则上和外科手术相同。在利用超净台工作时,因整个前臂要伸入超净台内,洗刷时一定要清洗到肘部。3.火焰消毒:在无菌环境进行培养或做其它无菌操作时,首先要点燃酒精灯。以后操作,如安装吸管帽、启开或封闭瓶口等,都需经过火焰烧灼后在火焰近处进行。金属器械在火焰上烧得时间不能过长,以防退火。烧过的金属都要冷却后再使用,以免造成组织损伤。已吸取过营养液的吸管不能再用火焰烧灼,因吸管头中残留营养液能烧焦形成炭膜,再用时会把有害物带入培养液中。消毒火焰要求无色或微蓝色,而红黄色或发黑的火苗,表示燃烧不完全或含有杂质,有害物能混入培养液内。因此酒精灯需用96%的不含杂质的酒精,绝不能使用含有二甲苯和甲醇的酒精。4.培养操作:进行培养操作时,动作要准确敏捷,但又不必太快,以防空气流动,增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿,如已接触,要用火焰烧灼消毒触及部,如不便消毒时,应取备品更换。为便于拿送用品,工作台面上的用品要有合理的布局;原则上应是右手使用的东西放置在右侧,左手用品在左侧,酒精灯置于中央。培养液在用过之后如不再重复使用,应立即封闭瓶口。培养用瓶开口以后,应保持45 度斜位或平放,长时间开口向上直立可增加落菌机会。吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时,均应分别使用吸管,不能混用,以防扩大污染或导致交叉污染。工作中不能面向操作野讲话或咳嗽,以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。(四)操作步骤1.组织块法(以乳鼠肺组织原代培养为例)(1)取材将1-3天新生乳鼠,尾巴提起,整个身体浸入75%酒精的烧杯中3秒左右(默数5下),取置灭菌的培养皿中,移入工作台内。小鼠仰位固定在泡沫塑料板上,大头针分别固定鼠头、尾和四肢。安尔碘消毒胸廓部位皮肤。在胸廓正中线中位处,用两把眼科弯镊(第1套器械)夹起皮肤(多夹些),向左右两侧头端撕拉,膈肌部位皮肤向尾端拉,膈肌部位皮肤向尾端拉,皮肤外翻固定,躯干部肌肉暴露(注意!不要使表皮面接触到已暴露出来的胸腹肌)。酒精消毒胸廓后,沿着膈膜剪断胸廓,并将胸骨两侧肋骨剪断(第II套器械)。胸廓暴露后,可见跳动心脏和粉红色肺。将眼科镊弯头端向上(第III套器械),从心脏右上方位插入心肺连接处,轻轻向上用力,将心肺一齐取出,用镊子去除心脏,移入已加Hank's液的青霉素瓶内。(2)漂洗用Hank’s液漂洗肺脏表面血污,然后粗剪几下,再用Hank's液漂洗多次后,吸去多余水分。(3)剪切
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