1. 随机引物法进行DNA标记: a. 参考如下表格设置反应体系: DNA———————————————————————————————10µl(100ng) Reaction Buffer (10X)——————————————————————5µl 125µM random decamer or hexamer primer——————————————10µl 补充无核酸酶的去离子水——————————————————————至40μl 混匀后沸水浴孵育5-10分钟,立即置于冰浴冷却。进行后续步骤前离心沉淀液 3 dNTP Mixture (0.25mM each , without the labeled—————————4μl [α-32P]-dNTP, ~110 TBq/mmol (3000Ci/mmol)————————————1.85MBq (50μCi) Klenow Fragment,Exo-———————————————————————1µl (5U) 补充无核酸酶的去离子水———————————————————————至50µl b. 按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。 c. 对于random decamer primer,37℃孵育5分钟;对于random hexamer primer,37℃孵育10分钟。 d. 加入4μl 0.25mM dNTP,混匀后37℃孵育5分钟。 e. 加入1μl 0.5M EDTA,pH8.0终止反应。 f. 取1μl上述液体用于检测标记的效率。 g. 用Sephadex G-50或Bio-Gel P-60或其它适当试剂盒纯化标记好的探针。
2. 双链DNA 5’突出(5’ overhang)末端的标记: a. 参考如下表格设置反应体系: Digested DNA ——————————————————————————10~15µl(0.1~4μg) Reaction Buffer (10X)——————————————————————2µl [α-32P]-dNTP, ~15-30 TBq/mmol(400-800Ci/mmol) —————————0.74 MBq(20μCi) 或 [α-32P]-dNTP, ~110 TBq/mmol(3000Ci/mmol)———————————2.96 MBq(80μCi) 3 dNTP Mixture (2.5mM each , without the labeled)————————2μl Klenow Fragment,Exo-———————————————————————0.2μl (1U) 补充无核酸酶的去离子水———————————————————————至20µl b. 按上述体系配好之后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。 c. 30℃孵育15分钟。 d. 75℃孵育10分钟终止反应。