活死细胞双染试剂盒， Calcein-AM/PI

活死细胞双染试剂盒， Calcein-AM/PI
Calcein-AM/PI Double Staining Kit
Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒内含两种染料：Calcein-AM和Propidium Iodide (PI)。这个试剂盒可在荧光显微镜下同时观察在同一个细胞培养皿中的活细胞和死细胞。Calcein-AM可透过细胞膜，通过活细胞内的酯酶作用脱去AM基团，产生的Calcein(钙黄绿素)发出强绿色荧光，因此活细胞在荧光显微镜下可被检测到绿色荧光。另一方面PI可以通过受损的细胞膜进入到死细胞内并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光，因此死细胞会被检测到红色荧光。除了用荧光显微镜外，也有报道可以用流式细胞仪和荧光酶标仪来进行定量检测。

• 荧光特性：　
  Calcein-AM : λex=490 nm , λem=515 nm
  PI : λex=530 nm , λem=580 nm

• 
  500 次 3000 次
  ・Calcein-AM Reagent 200 μg x 1 1 mg x 1
  ・PI Stock Solution (1.5 mmol/l) 200 μl x 1 1 ml x 1
  ・DMSO 200 μl x 1 1 ml x 1
  

染色试剂的最佳浓度
由于不同细胞种类、细胞浓度的染色条件不同，我们建议自行摸索一下Calcein-AM和PI的最适浓度。
Calcein-AM和PI的最佳浓度是根据不同的细胞种类而定，通过以下的操作，我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度：
1. 通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中培养10 min或通过在70%乙醇中培养30 min制备死细胞。
2. 用0.1-10 μM PI溶液染死细胞，以便找到仅针对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。
3. 用0.1-10 μM Calcein-AM溶液染死细胞，以便找到不对细胞质染色的Calcein-AM浓度，再以此浓度的Calcein-AM对活细胞染色以检验活细胞是否被染色。

Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内,发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate）相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein(钙黄绿素)不会抑制任何的细胞功能如增殖或淋巴球的趋化性。另外，使用了Calcein(钙黄绿素)的活性检测的实验结果是十分可信并且与标准的⁵¹Cr-释放法所得结果相一致的。Calcein(钙黄绿素)的激发和发射波长分别为490 nm和515 nm。
Calcein-AM和碘化丙啶（PI）溶液，它们分别可对活细胞和死细胞染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜，通过活细胞内的酯酶作用，Calcein-AM能脱去AM基，产生的Calcein(钙黄绿素)能发出强绿色荧光，因此Calcein-AM仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（激发：535 nm，发射：617 nm），因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein(钙黄绿素)和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发，仅可观察到死细胞。根据以上特点，Calcein-AM和碘化丙啶（PI）经常被结合用来作为活细胞和死细胞的双重染色。
由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定Calcein-AM和PI的合适浓度。
染色例：




染色过程：
1． 用DMSO制备1 mM 的Calcein-AM溶液，并用PBS将其稀释制成1-50 μM的Calcein-AM溶液。^a)
2． 将1/10细胞培养基体积的Calcein-AM溶液加入到细胞培养基中。^b)
3． 在37℃培养细胞15-30分钟。
4． 用PBS或适当的缓冲液洗涤细胞两次。
5． 用490 nm激发波长，515 nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。
a) 如果Calcein-AM很难进入细胞，可以使用表面活性剂，如Pluronic F127。
b) 或者您也可以用1/10浓度的Calcein-AM溶液代替培养基。

Calcein-AM可以用来进行活细胞、死细胞的双重染色
钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)溶液，它们分别可对活细胞和死细胞染色。Calcein -AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜。尽管Calcein -AM本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein -AM能脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光（激发：490 nm，发射：515 nm）。因此Calcein -AM仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（激发：535 nm，发射：617 nm）。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发，仅可观察到死细胞。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定PI和Calcein -AM的合适浓度。

I．试剂
Calcein-AM
PI

II．用荧光显微镜观察细胞形态
以HeLa细胞染色为例,请注意不同的细胞种类、不同浓度有不同的观察条件。根据细胞条件，摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓度的配制等最佳条件。
1．染色溶液的配制
1）用1 ml无水DMSO溶解1 mg Calcein-AM，制备成1 mmol/l 的Calcein-AM储备液，-20℃下密闭冷冻保存。
2）用1 ml ddH₂O溶解1 mg PI，制备成1.5 mmol/l的PI储备液（1 mg PI/1 ml H₂O），-20℃下密闭冷冻保存。
3）将Calcein-AM储备液和PI储备液放置于室温。
4）加10 μl Calcein-AM储备液和15 μl PI储备液至5 ml PBS中配制成染色溶液。
Calcein-AM的终浓度为2μmol／l，PI的终浓度为4μmol／l。

2．细胞染色
1）染色HeLa细胞等贴壁细胞时,先用Trypsin-EDTA等消化细胞，制备成细胞悬液。
2）将细胞悬液离心3分钟(1,000 rpm)。
3）去除上清液，加入PBS缓冲液，细胞数量调整至10⁵ –10⁶ 个／ml。再用移液器充分混匀。
4）由于培养基中的血清等含有酯酶，Calcein-AM遇水会分解，会导致空白上升，所以需要离心数次，用PBS洗涤数次直到完全洗净。
5）将200 μl细胞悬液移至小试管中，加入100 μl染色溶液，在37℃下孵育15分钟。
6）在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。
7）在荧光显微镜下，先使用490±10nm波长激发，观察黄绿色的活细胞，还可以同时观察到红色的死细胞，然后用545 nm波长激发，能够看到红色的死细胞。
*在荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以用培养基清洗掉细胞外的染料后再观察。
*Calcein-AM溶液和PI溶液可以混合在一起染色，也可以分开进行染色，加入的先后顺序没有影响。

3．染色试剂的最佳浓度
Calcein-AM和PI的最适浓度是根据不同的细胞种类而定，通过以下的操作，我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度。
1）通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育10分钟或通过在70％乙醇中孵育30分钟制备死细胞。
2）用0.1-10 μM 的PI溶液对死细胞染色，以便找到仅对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。
3）用0.1-10 μM 的Calcein-AM溶液对死细胞染色，以便找到不对细胞质染色的Calcein -AM浓度。接着用该浓度的Calcein -AM对活细胞染色以检验活细胞可否被染色。

III．注意事项
1） Calcein-AM的ester部位遇到湿气会分解，使用后请在-20℃下密闭冷冻保存，防止水分进入。Calcein-AM储备液用缓冲液或培养基等稀释时尽量现配现用。
2）PI溶液在冷冻的条件下可以保存一年。PI有引致癌的可能性,请在使用时注意以下3点。
·使用时一定要带手套、眼罩、口罩。
·万一接触到皮肤的话，迅速使用大量水清洗。
·处理方法
使用器具的洗涤液等废液请按照不同的处理方法来处理，或者按照如下的处理方法，分解后再丢弃。用UV照射或光照分解。用次lusuanna氧化分解后，做中和处理。
文献：