快速DNA连接试剂盒供应

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北京百奥莱博专业生产销售快速DNA连接试剂盒供应，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

快速DNA连接试剂盒供应
英文名：Rapid DNA Ligation Kit
品牌：百奥莱博
产地：国产|进口
编号：YT028
规格：100次|500次

快速DNA连接试剂盒是我公司研发的一种把DNA*(代"片")段在短至5分钟内快速插入到载体(vector)中的连接试剂盒。对于双粘端DNA*(代"片")段的插入仅需5分钟即可完成，对于双平端DNA*(代"片")段的插入仅需15分钟即可完成。同时本试剂盒也可以用于其它各种常规的双链DNA连接反应。
本试剂盒可以用于PCR片段和载体的连接、酶切产物和载体的连接、linker和载体的连接、linker和linker的连接等各种双链DNA的连接。
为了获得快速高效的连接效果，本试剂盒采用了一种特殊的高活力DNA连接酶，即Rapid T4 DNAligase，确保在短时间内可以获得很好的连接效果。
为了方便后续连接产物转化细菌，我公司对本试剂盒的快速连接缓冲液进行了优化，在确保连接效果的同时，确保完成连接后不必进行任何纯化即可直接转化细菌。另外，快速连接缓冲液中已经含有ATP、镁离子等各种必需物质，无需再添加其它任何试剂。
本试剂盒用于总体积为10μl的连接体系时可以进行100个连接反应，用于总体积为20μl的连接体系时可以进行50个连接反应。
保存条件：
-20℃保存。
注意事项：
连接反应完成后即可直接转化细菌，请勿采用加热方法失活Rapid T4 DNA ligase。加热处理会导致后续的转化效率显著下降。
对于载体单酶切插入外源片段的情况，需注意对载体进行脱磷处理，以避免质粒自连。

使用说明：
1. PCR产物或酶切片段和普通载体的连接：
a. 取1-2μg载体酶切过夜，或至少酶切3-5小时以上。尽量确保酶切充分，否则后续会导致产生很多自连的克隆。
b. 载体酶切完毕后，可以使用试剂盒进行纯化，例如PCR纯化试剂盒/DNA纯化试剂盒(D0033)。也可以采用常规的酚氯*(代"仿")抽提乙醇沉淀方法纯化载体。对于酶切产生较大片段(大于50-60bp)的情况推荐采用切胶回收的方式。
c. 对于PCR产物：PCR产物凝胶电泳后，切胶回收预期大小的DNA*(代"片")段。凝胶中DNA*(代"片")段的回收可以使用试剂盒进行操作，例如我公司的DNA凝胶回收试剂盒(D0056)。也可以采用反复冻融等方法回收DNA*(代"片")段。
d. 对于回收的PCR产物或其它需酶切的质粒或DNA*(代"片")段，用适当内切酶酶切，随后纯化酶切产物。注：这一步的酶切不必酶切特别充分，通常酶切效率能达到80-90%以上即可。即本步骤的酶切通常酶切1-2小时即可。酶切产物可以使用试剂盒进行纯化，例如我公司的PCR纯化试剂盒/DNA纯化试剂盒(D0033)。也可以采用常规的酚氯*(代"仿")抽提乙醇沉淀方法纯化载体。
e. 取约25-100ng经过酶切和纯化的载体，加入3倍摩尔数的待插入片段。参考下表设置连接反应体系。注：很多时候由于载体量和待插入片段的量都比较少，在回收后很难定量。此时可以根据回收前电泳条带的亮度进行大致的估计。通常以DNA分子量标准的某一条带为参考，估计或通过灰度半定量您的目的条带和该参考条带的亮度的比例关系。然后再按照预计的纯化或凝胶回收时的得率计算出最终得到的载体量和待插入片段量的比例关系。
载体 约25-50ng 约50-100ng
待插入片段 约载体摩尔数的3倍 约载体摩尔数的3倍
快速连接缓冲液(2X) 5μl 10μl
双蒸水或MilliQ水 至9.5μl 至19μl
Rapid T4 DNA ligase 0.5μl 1μl
总体积 10μl 20μl
f. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
g. 室温(25℃)孵育连接5-10分钟或更长时间。对于双平端连接需室温(25℃)孵育15-30分钟或更长时间。注1：对于双粘端连接：孵育5分钟通常可以达到孵育更长时间所能达到最佳连接效率的70-80%以上。孵育15分钟和孵育更长时间如60分钟等相比，无显著差异。连接5分钟后，如果转化等后续步骤还没有准备好，完全可以适当延长连接时间。但通常不宜超过60分钟。如果可能超过60分钟，可以在4℃或16℃放置较长时间甚至过夜。注2：对于双平端连接：孵育15分钟通常可以达到孵育更长时间所能达到最佳连接效率的70-80%以上。孵育30分钟和孵育更长时间如60分钟等相比，无显著差异。连接15分钟后，如果转化等后续步骤还没有准备好，完全可以适当延长连接时间。但通常不宜超过60分钟。如果可能超过60分钟，可以在4℃或16℃放置较长时间甚至过夜。注3：上述连接效率的数据在25℃时获得，在20-27℃时获得的连接效率比较接近。室温较低或较高时推荐在25℃水浴进行连接。
h. 随后即可直接取连接产物用于转化感受态细菌。
2. PCR产物和T载体的连接：
a. PCR产物凝胶电泳后，切胶回收预期大小的DNA*(代"片")段。凝胶中DNA*(代"片")段的回收可以使用试剂盒进行操作，例如我公司的DNA凝胶回收试剂盒(D0056)。也可以采用反复冻融等方法回收DNA*(代"片")段。
b. 按照T载体的说明书取适量T载体，加入3倍摩尔数的待插入片段。参考下表设置连接反应体系。注：很多时候由于载体量和PCR产物的量都比较少，在回收后很难定量。此时可以根据回收前电泳条带的亮度进行大致的估计。通常以DNA分子量标准的某一条带为参考，估计或通过灰度半定量您的目的条带和该参考条带的亮度的比例关系。然后再按照预计的纯化或凝胶回收时的得率计算出最终得到的载体量和PCR产物的量的比例关系。
T载体 适量 适量
待插入片段 约载体摩尔数的3倍 约载体摩尔数的3倍
快速连接缓冲液(2X) 5μl 10μl
双蒸水或MilliQ水 至9.5μl 至19μl
Rapid T4 DNA ligase 0.5μl 1μl
总体积 10μl 20μl
c. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
d. 室温孵育5-10分钟或更长时间。
注：孵育5分钟通常可以达到孵育更长时间所能达到最佳连接效率的70-80%以上。孵育15分钟和孵育更长时间如60分钟等相比，无显著差异。连接5分钟后，如果转化等后续步骤还没有准备好，完全可以适当延长室温的连接时间。但通常不宜超过60分钟。如果可能超过60分钟，可以在4℃或16℃放置较长时间甚至过夜。
e. 随后即可直接取连接产物用于转化感受态细菌。
3. Linker或RNAi片段和载体的连接：
a. 载体的酶切和纯化同步骤1a和1b。
b. Linker或RNAi片段的退火可以选择适当的DNA退火缓冲液，例如我公司的Annealing Buffer for DNA Oligos(5X)(D0251)， 进行退火反应。
c. 长度大于8bp的Linker或退火的RNAi片段，可以按照5:1至10:1的比例和载体进行连接反应。例如载体为0.03pmol，则插入片段可以为0.15至0.3pmol。长度小于8bp的linker，比例需调整为10:1以上。
d. 除插入片段的用量外，随后按照步骤1e，1f，1g，和1h进行。
4. DNA自身环化的连接：
参考步骤1e，待插入片段换成适量的水即可。其余步骤按照步骤1f，1g，和1h进行。
5. 其它类型的DNA*(代"片")段连接参考上述方法进行。
常见问题：
1. 连接反应后转化效率很低或阳性克隆非常少：
a. 可能感受态细菌转化效率太低，用质粒作为阳性对照同时检测感受态的转化效率。
b. 可以尝试提高载体或插入片段的纯度。对于平端连接需注意适当延长连接时间。
c. 可能载体酶切不够充分，用未经连接的载体转化作为阴性对照。
d. 用存放DNA的溶液进行转化，作为阴性对照，检测感受态细菌是否存在问题。
想要了解更多关于快速DNA连接试剂盒供应的价格、品牌、厂家、说明书、促销信息，请和我们联系。此外我公司还销售下面的产品：
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多聚磷酸钠 PI 7758-29-4
B0301 优级新生牛血清(辐照灭菌)
邻硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷 Chicago sky blue 6B 19887-85-5
F030220 HRP标记兔抗马IgG抗体 Rabbit Anti-Horse IgG*HRP
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·Lipotap脂质体转染试剂
编号：YT183
英文名称：Lipofecter Liposomal Transfection Reagent
规格：0.6ml|1.5ml

Lipofecter脂质体转染试剂是一种适合于把质粒或
其它形式的核酸包括DNA、RNA、寡核苷酸，以及核酸蛋白复合物或带负电荷的蛋白转染到培养的真核细胞中的高效转染试剂。Lipofecter还可以进行活体动物的细胞转染，用于基因治疗等。
为了实现在真核细胞中高效转染的目的，磷酸钙沉淀法、脂质体、阳离子聚合物、病毒、显微注射、电转等许多方法被发展起来。但这些方法存在一个或多个缺点，包括有细胞毒性、重复性差、操作烦琐、转染效率相对较低或价格非常昂贵等。
我公司独立研发的Lipofecter脂质体转染试剂，尽量避免了上述缺点，实现了无明显细胞毒性、重复性好、操作简单、转染效率较高，并且价格非常优惠。
Lipofecter转染试剂是一种经过精心优化配制的阳离子脂质体，Lipofecter不仅适用于常规的质粒转染，也适用于siRNA转染。
和其它一些阳离子脂质体不同的是，使用Lipofecter转染时血清的存在不影响转染效率，这样可以减小去除血清对细胞的损伤。
Lipofecter对于贴壁细胞和悬浮细胞均适用，并且可以用于稳定表达细胞株的筛选。
Lipofecter的转染效率可以通过转染表达EGFP或其它荧光蛋白的质粒进行快速鉴定。
对于六孔板而言，一个包装的本转染试剂可以转染250个孔。
保存条件：
4℃保存，一年有效。
注意事项：
使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率。对于质粒，可以使用质粒大量抽提试剂盒(D0026)进行抽提，以保证可以获得较高的转染效率。
转染前细胞必须处于良好的生长状态。
需自备不含抗生素和glutamine的DMEM溶液。
Lipofecter不能vortex或离心，宜缓慢晃动混匀。
Lipofecter使用后请立即盖好盖子，避免长时间暴露在空气中，影响转染效率。



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·EMSA突变探针-ARE(1.75μM)
编号：YT206
规格：60μl

EMSA突变探针－ARE是用于EMSA(也称gel shift)研究的ARE consensus oligonucleotide的突变体。可以作为EMSA探针－ARE的阴性对照，用于EMSA结合反应中突变探针的冷竞争反应等。
EMSA突变探针－ARE的序列如下：
5"-ACT GAG GGT GAC TCA ATA AAA TC-3"
3"-TGA CTC CCA CTG AGT TAT TTT AG-5"
EMSA突变探针－ARE中ARE的公认的位点发生了突变，从而使相应的转录因子无法和该突变探针结合。在探针冷竞争反应中，正常的标记探针和ARE的结合的条带会被抑制；而在突变探针冷竞争反应(cold competition)中，正常的标记探针和相应转录因子的结合的条带不会被抑制。
1,阴性对照反应(标记探针)；2,常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针)；3,探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记探针)；4,突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记突变探针)；5,Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋目的转录因子的特异抗体)。
一个包装的突变探针，如果用于同位素标记EMSA探针的突变探针冷竞争反应，可以进行30-60个突变探针的冷竞争反应。
保存条件：
-20℃保存，一年有效。
注意事项：
避免加热到40℃以上，温度过高会导致双链DNA探针解聚成单链。而单链无法用于EMSA研究。

我公司正在打折促销分子生物学试剂全系列产品，恭候您的咨询选购快速DNA连接试剂盒供应。