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- 2025年11月06日
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文献和实验Real-time qPCR 手册——手把手教你从菜鸟到高手
。 3. 仪器设置 所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（program setup）。我们以 ABI StepOne 为例，详细看一下反应设置： A. 首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为「BioTeke」，进行「定量」实验。 B. 实验方法的选择：我们选用的比较 Ct 的 SYBR Green 方法， Fast 程序，以 cDNA 为模板进行。 C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。 D. 样品的设置：包括
Real-time qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手
为“BioTeke”，进行“定量”实验。 B. 实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA为模板进行。 C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。 D. 样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。 E. 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备 F. 反应程序的设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要
PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束
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