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- KL013Rb01
- 2025年10月21日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20℃
- 保质期：
6-12months
- 英文名：
Recombinant Bone MoKLogenetic Protein 2 (BMP2)
- 库存：
大量
- 供应商：
康朗生物
- 规格：
50ug/100ug/1mg
www.shklbio.com
1.基因扩增
（1）引物合成
搜索目标蛋白基因信息，结合蛋白的结构信息，选取片段或全长设计引物。注意避开跨膜区，以及复杂的二级结构，优选N端或C端，引物评分尽可能高，并搜索出核酸序列的酶切位点，使用载体等信息。经研发部根据研发经验提出修改意见最终定稿后交由第三方公司进行引物合成。
（2）基因克隆机重组鉴定
1）PCR
根据目的蛋白特异性表达组织，选取特异组织RNA用上述引物进行PCR扩增。进行琼脂糖凝胶电泳后，根据分子量大小选取目标片段进行切胶回收。再次PCR扩增，获得大量DNA，并进行PCR产物回收。
2）酶切，连接
根据酶切位点，将目标PCR产物以及相应载体进行酶切，获得粘性末端的DNA产物后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应片段切胶回收。并将具有相同酶切位点的载体与DNA片段进行连接
3）转化，挑菌验证
将连接好的目的片段转化感受态E.coli,并在LB平板上进行过夜培养。挑取平板上的菌斑进行验证PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应菌液进行测序，测序正确后留种保存。
2.蛋白表达
（1）蛋白表达小试
挑取少量菌种进行培养，并诱导表达，将表达的蛋白进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达，小试表达成功后将进行蛋白预放大实验
（2）蛋白放大实验
将小试表达成功的蛋白菌株用400-800 ml培养基进行培养表达，进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达成功，预放大实验成功后将进行进一步的蛋白放大实验，放大实验使用800-1600 ml培养基进行培养，具体验证同上。
3.蛋白纯化
由于载体中包含了his标签，故采用镍柱进行纯化。有些蛋白可能会形成包涵体，在之前的一篇专题中我们有详细介绍过大肠杆菌重组蛋白纯化方法,纯化后的蛋白会进行SDS-PAGE， BCA等实验分子量以及纯度进行验证，纯度超过95%。
4. 质量检测
获得蛋白后会进行冻干，冻干之后会进行常规蛋白实验进行验证，合格后保存。
重组蛋白的制备主要是依据以上原理及步骤。以上是以原核表达举例。在制备过程中每一个环节都至关重要，不同的蛋白会在不同的环节出现技术难点，包括目的基因的扩增，包涵体的形成都会对重组蛋白的研发造成困境。但Cloud Clone Corp. 具有多年研发经验，还可提供真核表达系统，哺乳动物细胞表达系统，用户可根据需要选择，同时对蛋白有特殊要求我们也可提供私人定制。
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文献和实验性抗体间接捕获与其结合的靶蛋白（prey protein）。 Pull-down：另外一种进行蛋白-蛋白相互作用研究的方法，针对无法找到可用的抗体的靶蛋白。可以采用一个表位标记蛋白质（可在细胞内组成型表达），将其固定在基质上获得互作蛋白。很多蛋白质由于无法找到可用的抗体而无法进行免疫沉淀。 co-IP 实验流程 由于co-IP 相对问题较多，本文以 co-IP 为例进行介绍 Step 1：固定抗体 Step 2：加样 Step 3：结合，去除非特异性蛋白 Step 4：靶蛋白（红色）洗脱
-β)1、2、3，骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)2、6、9、13，胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)，软骨源性发生蛋白cartilage-derived morphogenetic protein，CDMP)1、2及地塞米松等。TGF-β主要作用于诱导的早期阶段，一般认为通过其受体激活Smad传导通路而启动软骨特异性基因的转录，主要是上调Ⅱ型胶原的表达与合成。BMP2、6等则可明显增强聚集蛋白
Clin Invest. 2009 简介： 中南大学第二湘雅医院的研究人员发现，miR-2861可通过转录后水平抑制HDAC5的表达而促进小鼠成骨细胞分化。在BMP2诱导的骨形成模型中，miR-2861由ST2间质细胞表达，并促进BMP2诱导的成骨细胞生成，而抑制miR-2861则可削弱这个作用。在正常小鼠及卵巢切除小鼠模型中，利用micrOFFTM antagomir-2861抑制miR-2861的表达，可引起HDAC5的表达上调和RUNX2的表达下调，并抑制骨形成和减少骨质
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