- ￥1280 - 3980
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- 2025年07月11日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保质期：
6-12months
- 英文名：
Recombinant Meteorin (METRN)
- 库存：
大量
- 供应商：
康朗生物
- 规格：
50ug/100ug/1mg/50ug/100ug/1mg
| 规格： | 50ug/100ug/1mg | 产品价格： | ￥1280.0-￥3980.0 |
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| 规格： | 50ug/100ug/1mg | 产品价格： | ￥1280.0-￥3980.0 |
www.shklbio.com
1.基因扩增
（1）引物合成
搜索目标蛋白基因信息，结合蛋白的结构信息，选取片段或全长设计引物。注意避开跨膜区，以及复杂的二级结构，优选N端或C端，引物评分尽可能高，并搜索出核酸序列的酶切位点，使用载体等信息。经研发部根据研发经验提出修改意见最终定稿后交由第三方公司进行引物合成。
（2）基因克隆机重组鉴定
1）PCR
根据目的蛋白特异性表达组织，选取特异组织RNA用上述引物进行PCR扩增。进行琼脂糖凝胶电泳后，根据分子量大小选取目标片段进行切胶回收。再次PCR扩增，获得大量DNA，并进行PCR产物回收。
2）酶切，连接
根据酶切位点，将目标PCR产物以及相应载体进行酶切，获得粘性末端的DNA产物后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应片段切胶回收。并将具有相同酶切位点的载体与DNA片段进行连接
3）转化，挑菌验证
将连接好的目的片段转化感受态E.coli,并在LB平板上进行过夜培养。挑取平板上的菌斑进行验证PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应菌液进行测序，测序正确后留种保存。
2.蛋白表达
（1）蛋白表达小试
挑取少量菌种进行培养，并诱导表达，将表达的蛋白进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达，小试表达成功后将进行蛋白预放大实验
（2）蛋白放大实验
将小试表达成功的蛋白菌株用400-800 ml培养基进行培养表达，进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达成功，预放大实验成功后将进行进一步的蛋白放大实验，放大实验使用800-1600 ml培养基进行培养，具体验证同上。
3.蛋白纯化
由于载体中包含了his标签，故采用镍柱进行纯化。有些蛋白可能会形成包涵体，在之前的一篇专题中我们有详细介绍过大肠杆菌重组蛋白纯化方法,纯化后的蛋白会进行SDS-PAGE， BCA等实验分子量以及纯度进行验证，纯度超过95%。
4. 质量检测
获得蛋白后会进行冻干，冻干之后会进行常规蛋白实验进行验证，合格后保存。
重组蛋白的制备主要是依据以上原理及步骤。以上是以原核表达举例。在制备过程中每一个环节都至关重要，不同的蛋白会在不同的环节出现技术难点，包括目的基因的扩增，包涵体的形成都会对重组蛋白的研发造成困境。但Cloud Clone Corp. 具有多年研发经验，还可提供真核表达系统，哺乳动物细胞表达系统，用户可根据需要选择，同时对蛋白有特殊要求我们也可提供私人定制。
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文献和实验螯合树脂 用于分离 6XHis 标签重组蛋白，高度结合效率和低的非特异性结合。 固定的金属亲和层析树脂（IMAC）使用镍离子来纯化 6XHis 标签蛋白。树脂可以结合 6X 组氨酸残基（6XHis），一种在蛋白纯化中非常常用的标签。树脂由氨基二乙酸偶联到 6% 交联的琼脂糖上组成。氨基二乙酸可以共价结合到镍离子上，每毫升树脂可以结合 20-40μmoles 镍离子。 这种镍螯合树脂有单独的树脂也有离心柱形式供选择。 特定的结合和洗脱缓冲液液可以提供， 100 ml His 结合
6xHis 标签，也称为多组氨酸标签， His6 标签或 hexa 组氨酸标签, 是一种在转染的细胞中目标蛋白的 C 端或 N 端上由至少 6 个组氨酸残基链接上所组成的氨基酸序列。这种标签通常在重组蛋白的纯化中使用，这是因为组氨酸残基的序列可以在特定的缓冲液条件下结合到几种类型固定的离子上（比如镍，钴和铜）从而达到容易检测和纯化 His 标签蛋白的目的。 由于它的相对小的分子量，低的免疫原性，亲水性和在去污剂和其他添加剂存在的情况下的易变性, 因此在天然和变性的条件下，多组氨酸标签
【原创】真核表达His蛋白，进行天然构象蛋白纯化的心得和疑问。
由于要做酶活性实验，所以选择真核表达His标签蛋白进行非变形的纯化。（避免了原核表达可能得到没功能的蛋白。）先上图上真相：这个说明了：细胞超声裂解后，离心沉淀的碎片里含少量His标签的过表达目的蛋白（第一道），上清里含大量His蛋白（第二道）。之后用特殊的含有镍的树脂小球纯化His蛋白，由于裂解液体积太大了，就分了两次加到柱子里。第一次加进去之后4度孵育1h，然后弃流出液（第三道），第二次把剩下的裂解液加进去，同样4度孵育1h后弃流出液（第四道）然后用漂洗液洗2次柱子里的树脂，使得非特异性黏着
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