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- 2025年07月15日
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6-12months
- 英文名：
Recombinant Pyruvate Dehydrogenase Kinase Isozyme 2 (PDK2)
- 库存：
大量
- 供应商：
康朗生物
- 规格：
50ug/100ug/1mg/50ug/100ug/1mg
| 规格： | 50ug/100ug/1mg | 产品价格： | ￥1280.0-￥3980.0 |
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| 规格： | 50ug/100ug/1mg | 产品价格： | ￥1280.0-￥3980.0 |
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1.基因扩增
（1）引物合成
搜索目标蛋白基因信息，结合蛋白的结构信息，选取片段或全长设计引物。注意避开跨膜区，以及复杂的二级结构，优选N端或C端，引物评分尽可能高，并搜索出核酸序列的酶切位点，使用载体等信息。经研发部根据研发经验提出修改意见最终定稿后交由第三方公司进行引物合成。
（2）基因克隆机重组鉴定
1）PCR
根据目的蛋白特异性表达组织，选取特异组织RNA用上述引物进行PCR扩增。进行琼脂糖凝胶电泳后，根据分子量大小选取目标片段进行切胶回收。再次PCR扩增，获得大量DNA，并进行PCR产物回收。
2）酶切，连接
根据酶切位点，将目标PCR产物以及相应载体进行酶切，获得粘性末端的DNA产物后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应片段切胶回收。并将具有相同酶切位点的载体与DNA片段进行连接
3）转化，挑菌验证
将连接好的目的片段转化感受态E.coli,并在LB平板上进行过夜培养。挑取平板上的菌斑进行验证PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应菌液进行测序，测序正确后留种保存。
2.蛋白表达
（1）蛋白表达小试
挑取少量菌种进行培养，并诱导表达，将表达的蛋白进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达，小试表达成功后将进行蛋白预放大实验
（2）蛋白放大实验
将小试表达成功的蛋白菌株用400-800 ml培养基进行培养表达，进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达成功，预放大实验成功后将进行进一步的蛋白放大实验，放大实验使用800-1600 ml培养基进行培养，具体验证同上。
3.蛋白纯化
由于载体中包含了his标签，故采用镍柱进行纯化。有些蛋白可能会形成包涵体，在之前的一篇专题中我们有详细介绍过大肠杆菌重组蛋白纯化方法,纯化后的蛋白会进行SDS-PAGE， BCA等实验分子量以及纯度进行验证，纯度超过95%。
4. 质量检测
获得蛋白后会进行冻干，冻干之后会进行常规蛋白实验进行验证，合格后保存。
重组蛋白的制备主要是依据以上原理及步骤。以上是以原核表达举例。在制备过程中每一个环节都至关重要，不同的蛋白会在不同的环节出现技术难点，包括目的基因的扩增，包涵体的形成都会对重组蛋白的研发造成困境。但Cloud Clone Corp. 具有多年研发经验，还可提供真核表达系统，哺乳动物细胞表达系统，用户可根据需要选择，同时对蛋白有特殊要求我们也可提供私人定制。
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使用：乳酸是葡萄糖不完全氧化的产物。研究表明，体外培养条件下95％的葡萄糖转变为乳酸，这降低了营养物质的代谢效率，降低培养基pH值，增加渗透压。在氧气供给不足的情况下，NADH转运系统苹果酸－天冬氨酸穿梭系统活性低而不能将糖酵解产生的NADH氧化磷酸化为NAD+，细胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脱氢酶将糖酵解产生的丙酮酸与NADH反应生产乳酸和NAD+，从而保证了糖酵解的顺利进行。另一个可能的解释是连接糖酵解与TCA循环的特异性酶如丙酮酸脱氢酶复合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化
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