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- KL315Ga011
- 2025年07月16日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20℃
- 保质期：
6-12months
- 英文名：
Recombinant Calmodulin 1 (CALM1)
- 库存：
大量
- 供应商：
康朗生物
- 规格：
50ug/100ug/1mg
www.shklbio.com
应用重组DNA将目标基因进行表达得到的蛋白质成为重组蛋白，重组蛋白在生物信号传导过程，药物研发，科学研究中扮演着重要角色。下面来介绍一下重组蛋白的生产工艺流程。
1.基因扩增
（1）引物合成
搜索目标蛋白基因信息，结合蛋白的结构信息，选取片段或全长设计引物。注意避开跨膜区，以及复杂的二级结构，优选N端或C端，引物评分尽可能高，并搜索出核酸序列的酶切位点，使用载体等信息。经研发部根据研发经验提出修改意见最终定稿后交由第三方公司进行引物合成。
（2）基因克隆机重组鉴定
1）PCR
根据目的蛋白特异性表达组织，选取特异组织RNA用上述引物进行PCR扩增。进行琼脂糖凝胶电泳后，根据分子量大小选取目标片段进行切胶回收。再次PCR扩增，获得大量DNA，并进行PCR产物回收。
2）酶切，连接
根据酶切位点，将目标PCR产物以及相应载体进行酶切，获得粘性末端的DNA产物后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应片段切胶回收。并将具有相同酶切位点的载体与DNA片段进行连接
3）转化，挑菌验证
将连接好的目的片段转化感受态E.coli,并在LB平板上进行过夜培养。挑取平板上的菌斑进行验证PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应菌液进行测序，测序正确后留种保存。
2.蛋白表达
（1）蛋白表达小试
挑取少量菌种进行培养，并诱导表达，将表达的蛋白进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达，小试表达成功后将进行蛋白预放大实验
（2）蛋白放大实验
将小试表达成功的蛋白菌株用400-800 ml培养基进行培养表达，进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达成功，预放大实验成功后将进行进一步的蛋白放大实验，放大实验使用800-1600 ml培养基进行培养，具体验证同上。
3.蛋白纯化
由于载体中包含了his标签，故采用镍柱进行纯化。有些蛋白可能会形成包涵体，在之前的一篇专题中我们有详细介绍过大肠杆菌重组蛋白纯化方法,纯化后的蛋白会进行SDS-PAGE， BCA等实验分子量以及纯度进行验证，纯度超过95%。
4. 质量检测
获得蛋白后会进行冻干，冻干之后会进行常规蛋白实验进行验证，合格后保存。
重组蛋白的制备主要是依据以上原理及步骤。以上是以原核表达举例。在制备过程中每一个环节都至关重要，不同的蛋白会在不同的环节出现技术难点，包括目的基因的扩增，包涵体的形成都会对重组蛋白的研发造成困境。但Cloud Clone Corp. 具有多年研发经验，还可提供真核表达系统，哺乳动物细胞表达系统，用户可根据需要选择，同时对蛋白有特殊要求我们也可提供私人定制。
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文献和实验树脂结构，6% 交联的琼脂糖 ● 「笑三少」-钙调蛋白树脂 钙调蛋白树脂用于亲和纯化钙调蛋白结合蛋白（CBP），包括带有 CBP 标签的重组蛋白和真核生物中钙调蛋白调控的蛋白。树脂是 4% 的琼脂糖偶联到钙调蛋白上，配基的密度是 1 ml 树脂大约是 1 mg 钙调蛋白。 钙调蛋白树脂有单独的树脂产品形式以及试剂盒形式，试剂盒包括： 5 ml 树脂， 100 ml 钙调蛋白结合/漂洗缓冲液， (50 mM Tris-HCl (pH7.5), 200 mM
pH与阳离子交换树脂或阴离子交换树脂结合，如钙调蛋白只能在pH2时与阳离子交换树脂结合。 6 疏水性 多数疏水性的氨基酸残基藏在蛋白质的内部，但也有一些在表面。蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分离的能力。 因其廉价和纯化后的蛋白质具有生物活性，是一种通用性的分离和纯化蛋白质的工具。高浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱，故特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后的含有目标
，因此有可能以微阵列的形式完成。 Zhu等人的最近工作证明对蛋白组学分析的阵列方法的非常能力。作者从S. cerevisiae中纯化5800不同种重组蛋白后，生产了包含该微生物90%基因的基因产物的复杂蛋白芯片。这些微阵列能用于研究全基因组范围内的蛋白-蛋白相互作用。利用钙调蛋白作模型蛋白来探查阵列，能够确证许多已知相互作用和测定一系列新的结合蛋白。这些蛋白的序列分析揭示存在一个结合基序，从而说明被发现的结合相互作用的重要性。用于检测蛋白-脂质相互作用的实验令人信服地说明鉴定能与低分子量复合物结合的蛋白
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