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- QM101-14
- 2025年11月13日
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低温保存
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一年
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齐一生物
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50200
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文献和实验几个复孔，选择重复性好的 CT 值参与计算。 （2）CT＜30，重复性较差。这种情况一般同操作有关。 解决办法：从以下几个方面进行问题的排查：①加样准确度；②移液器吸取液体的准确度；③定期校准 qPCR 仪。 ①加样准确度 避免小体积加样，减少加样误差。可以将引物、SYBR Green Mix、ddH2O 配置成混合体系，并且增加模板的稀释梯度，大体积加样。如：原液 cDNA 添加 1μl，可以更改为原液 cDNA 稀释 5 倍，添加 5μl，使用 ddH2O 补齐体系至 20μl 即可
PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束
Real-time qPCR 手册——手把手教你从菜鸟到高手
NaOH 中浸泡 10 分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。 当然，这些也不是绝对的要求。如果是操作熟练。完全可以用初次开封的离心管和枪头，新过滤的超纯水，进行 RNA 的提取。 2. Mix 配制 一般来讲，进行 real-time qPCR MasterMix 都是 2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于 real-time qPCR 灵敏度高，所以每个样品至少要做3 个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于 Ct 相差较多或者 SD 太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应
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