1.反应体系配制:
所有操作请在冰上进行,各组分解冻后请充分摇匀。为了防止HieffTM Pfu DNA Polymerase的校对活性降解引物,请将聚合酶最后加入反应体系中。各组分使用完毕后及时放回-20℃。5 × SF Buffer请勿长时间敞口放置。
ddH2O
to 50 μl
5×SF Buffer(with 10 mM Mg SO4)
10 μl
25 mM MgSO4a
optional
dNTP Mix(10 mM each)b
1 μl
DMSOc
optional
5×PCR Enhancerd
optional
模板DNAe
optional
引物1(10 μM)
2 μl
引物2(10 μM)
2 μl
HieffTM Pfu DNA Polymerase(1 U/μl)f
1 μl
注:a. 对于大多数PCR反应,Mg2+最佳终浓度为1.5-2 mM。体系中已含有终浓度为2 mM Mg2+,如有需要,可用25 mM MgSO4,以0.2-0.5 mM为间隔向上摸索Mg2+最佳使用浓度。
b. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。
c. 扩增子GC含量>60%时加入终浓度3%的DMSO有可能会有助于扩增。
d. 推荐仅当扩增子GC含量>60%且优化条件也无法正常扩增时使用;可能会降低保真度。
e. 不同模板最佳反应浓度有所不同,下表为50 μl反应体系推荐模板使用量:
模板种类/扩增长度
<1 kb
1 kb~10 kb
>10 kb
基因组DNA
50 ng~250 ng
100 ng~300 ng
150 ng~400 ng
质粒或病毒DNA
10 pg~20 ng
10 pg~20 ng
1 ng~30 ng
cDNA
1~5 μl(不超过PCR反应总体积的1/10)
f. 推荐的酶的终浓度为1U/50 μl反应。然而,根据扩增子的长度和复杂程度不同,可将HieffTM Pfu DNA Polymerase在0.5-2U/50 μl反应之间进行优化。但请勿超过2U/50 μl,尤其当扩增子长度大于5 kb时。HieffTM Pfu DNA Polymerase具有较强的校对活性。如扩增产物需要进行TA克隆,加A之前必须进行DNA纯化。
2. 一般PCR反应条件设置:
循环步骤
温度
时间
预变性a
95℃
30 sec~3 min
变性b
95℃
5~10 sec
25~35循环
退火c
45℃~72℃
10~30 sec
延伸d
72℃
15~30 sec/kb
彻底延伸
72℃
5~10 min
注:a. 推荐大多数模板的预变性温度为95℃, 时间为:质粒或病毒DNA,30 sec,基因组2 min,cDNA 3 min;对于高GC含量模板,预变性温度需提升至98℃,变性时间为2~4 min;对于超过10 kb的扩增子,预变性温度需降低至92℃,变性时间不超过2 min。
b. 对于大多数模板在95℃变性时间设为5~10 sec即可。对于高GC含量模板,变性温度需提升至98℃;对于超过10 kb的扩增子,变性温度需降低至92℃,并延长变性时间至15 sec。
c. HieffTM Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物高效退火。一般来说,退火温度设置为引物Tm值±3℃范围内之间即可。如果需要,可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状。因此,推荐退火时间设置为10 sec即可。对于一些困难模板,退火时间可在10~30 sec之间调整。
d. 对于大多数扩增反应,延伸过程可在72℃进行。对于超过10 kb的扩增片段,需降低延伸温度至68℃。延伸时间取决于扩增片段的长度和模板的复杂性。使用质粒等复杂程度较低的DNA做模板时,可使用15 sec/kb的延伸时间;使用基因组, cDNA等复杂程度较高的DNA做模板时,延伸时间应为30 sec/kb。太长的延伸时间会导致非特异性扩增增加,因此延伸时间请勿超过30 sec/kb。
3. 长片段PCR指南:
*使用高质量的模板;
*使用长引物。将引物加长至Tm值68~72℃,把退火/延伸温度合并为68℃。这样可以显著提高扩增特异性;
*适当提高酶量,但50 μl反应体系内不要超过2 U;
*添加DMSO,以1%的浓度递增。调整范围为0%~6%;
*推荐反应条件设置: