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上海信裕
1.当细胞铺满整个平皿(100mm)后,吸弃旧培养液,10mLPBS洗一遍
2.0.25%胰酶(预热20分钟左右)2ml消化,轻轻摇晃,MAK(BRDU)M-BMC 9318-IGG-FLUOR直至肉眼见单层细胞呈块状脱落(或在显微镜下观察细胞之间分离),立刻加5ml(DMEM+10%FBS)终止消化,轻柔吹打8-10次成单细胞。
3.离心1000rpm*5min,弃上清,加DMEM+10%FBS轻柔吹打。
4.将细胞悬液1:4传到100mm细胞培养皿中,每个皿加10ml(DMEM+10%FBS)培养液,正常情况下2-3天就可以长满,期间不用换液。
MAK(BRDU)M-BMC 9318-IGG-FLUOR的传代方法:首先在倒置显微镜下观察生长融合达80%,不需要长满,就准备传代。倒掉旧的培养基,再用已经高压灭菌过的PBS洗1-2次,我用的是25平方厘米的培养瓶,加入1毫升已经配制好的0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA(0.25%胰蛋白酶是用D-Hanks配制后先用滤纸过滤,再用一次性过滤器过滤除菌,MAK(BRDU)M-BMC 9318-IGG-FLUOR再分装成1ml的小包装,刚好每次用完一个,避免每次反复冻存,会使胰酶的活性下降),加入的量以刚好盖满瓶底为宜。放到倒置显微镜下观察变化,一旦发现细胞开始变园收缩,大约1-3分钟时间,必要时可以吹打帮助细胞分散,就立即加入培养基中和胰酶,如有EDTA最好要离心(800rpm,5min),弃上清夜,MAK(BRDU)M-BMC 9318-IGG-FLUOR再加入完全培养基吹匀,再分瓶,一般一瓶可以分2-3瓶。放入5%的CO2培养箱,37度培养24小时后观察。
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文献和实验can be labelled with BrdU and following the protocol were visualised with HRP conjugated secondary antibodies and DAB to produce a nuclear staining pattern. Scale = 100µm Fig. 2 BrdU protocol in vivo In vivo cells can be labelled either by injecting BrdU
Anti-BrdU-FITC (Becton Dickinson or Phoenix Flow) 0.15 M NaCl, 1.5 M NaCl 10 Paraformaldehype (kept as stock in -80°C) Tween 1M MgCl2 FACS Tubes Protocol: Cells in 96 well FACS plate Block with 24G-2 Surface stain cells
Anti-GFP/BrdU In Situ Immunostaining
IgG (Jackson ImmunoResearch, 111-096-006) Biotinylated anti-BrdU (AbCam, ab2284-125) Streptavidin-Alexa Flour 555 (Invitrogen/Molecular Probes, S21381) Goat serum Horse serum BSA 2N HCl DAPI Fluorescent mounting medium (Vectashield
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