质粒 DNA 大量提取试剂盒

二、自备试剂
无水乙醇，异丙醇
RNase A：-20℃保存。
Buffer GM1：细菌悬浮液。加入RNaseA后，混匀，4℃贮存。
Buffer GM2：细菌裂解液（含SDS/NaOH），室温密闭贮存。
Buffer GM3：中和液，室温密闭贮存。
Buffer WM：洗涤液，第一次使用前按照试剂瓶上指定加入无水乙醇，室温密闭贮存。
Elution：10mM Tris-HCl，pH8.0。室温密闭贮存。
三、注意事项
1、DNA呈酸性，建议在10mM Tris-HCl，pH8.0洗脱液中保存。
2、用平衡液处理过的柱子最好当天使用，放置时间过长会影响效果。
3、BufferGM2，Buffer GM3，含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、
眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。
4、溶液E可用无菌双蒸水代替（pH≥7.5），加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。
四、实验前试剂准备
1、第一次使用时将RNase A全部加入到Buffer GM1中，之后试剂4℃保存。
2、使用前Buffer WM中按照试剂瓶上指定量加入无水乙醇。
3、检查Buffer GM2是否出现沉淀，若有沉淀，应于37-65℃温浴溶解后再使用。
4、将Elution或双蒸水37-65℃预热，有利于提高洗脱效率。
五、操作步骤
1、取125ml培养过夜的菌液（根据质粒拷贝数以及菌体浓度来决定适合的菌液量，
低拷贝质粒可用250ml菌液），8000rpm离心10min，尽量除尽上清
（可用干净的吸水纸吸除瓶壁上的水滴或将离心瓶倒扣在吸水纸上）。
2、加入8ml Buffer GM1悬浮细菌沉淀，悬浮均匀，直至无菌块存在。
*可使用一次性吸管抽吸搅拌混匀（货号：SR-P-008）。
3、加入8ml Buffer GM2，温和并充分搅拌混匀3min使菌体充分裂解，直至溶液澄清粘稠。
*避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。
*此步骤不宜超过5min。混匀时用力不宜过度，看到溶液变粘变澄清即可。
4、加8ml Buffer GM3，温和并充分搅拌混匀，形成白色絮状沉淀，室温放置5min。
*加入Buffer GM3后应立即混合，以避免形成局部的沉淀。
*避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。
5、10,000rpm离心10min。
6、将上清转移至烧杯或离心管中，加入0.3倍体积的异丙醇，混合均匀。
*若沉淀未完全沉至管底，可用去蛋白滤膜加以过滤。
7、将溶液转移到离心柱中，静置2min。
*此步骤中上清一次转不完，可分三次离心。
8、12,000离心1 min，弃废液。
9、加入8ml Buffer WM（使用前加入无水乙醇），静置2min，10,000rpm离心1min，弃废液。
10、重复步骤9一次。
11、加入3ml无水乙醇，10,000rpm离心1min。
12、10,000 rpm再次离心2min以甩干剩余液体。
13、将离心管柱置于新的离心柱套管中，室温敞开离心管盖放置5-10min，向吸附膜中加入
1-2ml Elution，室温放置2min，12,000rpm离心2min，管底即为质粒DNA。
*为了增加质粒洗脱效率，可将得到的溶液再次加入离心柱中，重复步骤13。
六、纯化效果检测
1、DNA提取后得到的产物可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测完整性、浓度和纯度。
2、DNA在260nm处有吸收峰，检测时应该使OD₂₆₀值在0.1到1.0之间数值较准确。
OD₂₆₀为1时大概相当于50μg/ml双链DNA，40μg/ml单链DNA。
3、核酸浓度（μg/ml）=OD₂₆₀×50×稀释倍数。
4、OD₂₆₀/OD₂₈₀的值应该为1.7~2.0。
七、常见问题分析及建议
1、RNA残留。
1）Buffer GM1没加RNase A：将RNase A加入溶液Buffer GM1。
2）Buffer GM1中RNase A失活：Buffer GM1加入RNase后于4℃保存。
2、提取率低。
1）细菌培养过久：培养时间最好不要超过16 h。
2）质粒拷贝数低：加大菌的用量，并根据实际情况按比例加大溶液GM1、GM2、GM3的用量。
3）菌量过少，浓度过低：加大菌液用量。
4）菌体重悬不充分：加Buffer GM1后充分重悬。
5）Buffer WM中没有加入无水乙醇：确保溶液Buffer WM加入无水乙醇。
6）洗脱液使用不当：确保使用试剂盒提供的洗涤液。
7）洗脱不充分：确保足够洗脱时间和Elution用前37-65℃预热。
8）电泳缓冲液pH过高：确保待测样品电泳时使用新鲜缓冲液。