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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 供应商：
上海笃玛生物科技有限公司
- 检测范围：
电询
- 检测方法：
ELISA
- 应用：
电询
- 适应物种：
人
- 标记物：
电询
- 样本：
血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、组织匀浆等
- 规格：
48T/96T
| 规格： | 48T | 产品价格： | ￥1080.0 |
|---|---|---|---|
| 规格： | 96T | 产品价格： | ￥1896.0 |
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ELISA试剂盒显色法检测是一种常用的免疫学检测方法，可以和生物标志物的存在。然而，选择正确的ELISA试剂盒和显色方法对于获得准确和可靠的检测结果至关重要。本文将介绍选择ELISA试剂盒显色法检测的步骤和注意事项。
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一、确定检测目标
首先，您需要确定您要检测的目标是什么。这可以是某种特定的蛋白质、基因或微生物等。在选择ELISA试剂盒之前，您需要了解您要检测的目标的性质和特点，以便选择 的ELISA试剂盒。
二、选择合适的ELISA试剂盒
选择ELISA试剂盒时，您需要考虑以下几个因素：
1. 目标分子的类型：不同的ELISA试剂盒适用于不同的目标分子类型，例如蛋白质、基因或微生物等。因此，您需要选择适合您要检测的目标分子的ELISA试剂盒。
2. 灵敏度和特异性：灵敏度和特异性是衡量ELISA试剂盒性能的重要指标。灵敏度是指试剂盒能够检测到的 浓度，而特异性则是指试剂盒只对特定的目标分子产生反应。因此，您需要选择具有高灵敏度和特异性的ELISA试剂盒。
3. 操作简便性：ELISA试剂盒的操作应该简单易行，以便您可以快速获得准确的结果。因此，您需要选择操作简便、快速的ELISA试剂盒。
4. 价格和可用性： ，您需要考虑ELISA试剂盒的价格和可用性。不同的ELISA试剂盒价格各不相同，因此您需要根据您的预算和需求选择 的ELISA试剂盒。
三、选择合适的显色方法
在选择ELISA试剂盒之后，您需要选择合适的显色方法以获得准确的检测结果。显色方法的选择取决于您的目标分子和ELISA试剂盒的类型。以下是一些常见的显色方法：
1. TMB显色法：TMB是一种常用的显色底物，可以与辣根过氧化物酶反应生成蓝色产物，然后在酸的作用下变成黄色。这种方法具有高灵敏度和特异性，因此被广泛用于ELISA检测中。
2. 酚红-S显色法：酚红-S是一种常用的显色底物，可以与碱性磷酸酶反应生成红色产物，然后在酸的作用下变成黄色。这种方法也具有高灵敏度和特异性，但需要注意控制pH值以获得准确的检测结果。
3. 荧光显色法：荧光显色法是一种高灵敏度的显色方法，可以用于检测低浓度的目标分子。这种方法需要在特定的激发波长下产生荧光信号，因此需要使用特殊的仪器进行检测。
无论您选择哪种显色方法，您需要注意以下几点：
1. 显色方法的灵敏度和特异性：不同的显色方法具有不同的灵敏度和特异性，因此您需要选择具有高灵敏度和特异性的显色方法以获得准确的检测结果。
2. 显色方法的稳定性：显色方法的稳定性对于获得准确和可靠的检测结果至关重要。您需要注意观察显色方法的反应速率和终止条件，以确保在短时间内获得稳定的结果。
3. 显色方法的可重复性：可重复性是指相同条件下多次实验获得相同结果的能力。您需要选择具有高可重复性的显色方法，以确保您的实验结果具有可重复性和可比较性。
4. 显色方法的干扰因素： ，您需要考虑显色方法的干扰因素。某些物质可能会干扰显色反应，导致假阳性或假阴性结果。因此，您需要了解并避免这些干扰因素以获得准确的检测结果。
代理品牌：
酶联免疫吸附试验 (以下简称ELISA) ：是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
简介
自从Engvall和Perlman(1971） 报道建立酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA）以来，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。尽管早期的ELISA由于特异性不够高而妨碍了其在实际中应用的步伐，但随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。
如今ELISA方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面，ELISA在猪、猪伪、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。
基本原理
ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
特性
用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。如今应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。
辣根过氧化物酶
过氧化物酶（HRP）广泛分布于植物中，辣根中含量 ，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40 000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的 吸收光谱分别为275nm和403nm。
酶的纯度以RZ表示：RZ=OD403/OD275
纯酶的RZ多在3.0以上， 为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占 75%，不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：⑴邻二胺（OPD），产物为橙色，可溶性，敏感性高， 吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓硫酸终止反应，颜色可在数小时内不改变,是目前国内ELISA中最常用的一种；⑵联大茴香胺（OD），产物为橘黄色， 吸收值在400nm，颜色较稳定；⑶5－氨基水杨酸(5－AS）：产物为深棕色， 吸收值在449nm，部分溶解，敏感性较差；⑷邻联（OT）产物为蓝色， 吸收值在630nm，部分溶解，不稳定，不耐酸，但反应快，颜色明显。
碱性磷酸酶
系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取，由多个同功酶组成。它们的底物种类很多，常用者为硝基磷酸盐，廉价无毒性。酶解产物呈黄色，可溶， 吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反应系统中，37℃1分钟水解1μg磷酸二钠为一个单位。
标记方法
良好的酶结合物取决于两个条件：即高效价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要，因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中，抗体的活性有所降低，故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白， 使用亲和层析提纯的抗体，可提高敏感性，而且可稀释使用，减少非特异性吸附。
酶与抗体交联，常用法和过盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过法简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备。其标记程序为：将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06 mol/L的过（NaIO4）水溶液0.5ml，混匀置4℃冰箱30分钟 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30分钟后加入含5g纯化抗体的水溶液1ml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时（或过夜）使之结合，然后吸出，加（NaBH4）溶液（5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃冰箱30分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH7.4PBS中，并对之透析过夜（4℃），次日离心除去不溶物，即得到酶标抗体，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，进行测定后，冷冻干燥或低温保存。
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文献和实验标本的采集及保存
1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过一晚后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3.细胞培养物上清或其它生物标本：1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 (注：标本溶血会影响**检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。)
标本的稀释原则：首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。
标准品的稀释原则：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为300 pg/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/ml，临用前15分钟内配制。 如配制150 pg/ml标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
生物素标记抗体的稀释原则：临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素标记抗体加990μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
操作步骤
实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。 为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。
3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液） 100μl，37℃，60分钟。
5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。
7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后15分钟以内进行检测。
注意事项
1.用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
2.每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是加底物溶液及2N 。测量时先用此孔调OD值至零。
3.为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。
4.未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液或、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。
5.建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
计算
以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1.当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。
2.洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
3.一次加样时间**控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4.请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。
5.如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请乘以稀释倍数。
6.在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
7.底物请避光保存。
8.不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。
注意事项：收集标本前必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天进行检测的标本，储存在4 ℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本， 将标本及时分装后放在-20 ℃或-70 ℃条件下保存。避免反复冻融。标本2 -8 ℃可保存48 小时，-20 ℃可保存1 个月。-70度可保存6 个月。部分激素类标本需添加抑肽酶。
计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
试剂盒性能
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。
2.批内与批见应分别小于9%和15%
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