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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 供应商:
上海笃玛生物科技有限公司
- 检测范围:
电询
- 检测方法:
ELISA
- 应用:
电询
- 适应物种:
人
- 标记物:
电询
- 样本:
血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、组织匀浆等
- 规格:
48T/96T
| 规格: | 48T | 产品价格: | ¥1080.0 |
|---|---|---|---|
| 规格: | 96T | 产品价格: | ¥1896.0 |
1. 抗体或抗原的吸附:将待测抗原或抗体吸附到固相载体上,常用的载体有微孔板、玻璃纤维、聚苯乙烯等。这些载体表面具有特殊的化学基团,能够与待测抗原或抗体特异性结合。
2. 酶标记的抗体或抗原的结合:将酶标记的抗体或抗原与待测抗原或抗体结合,形成酶标记的抗原-抗体复合物。酶标记的抗体或抗原具有高度的特异性和亲和力,能够与待测抗原或抗体形成稳定的复合物。
3. 底物显色反应:当酶标记的抗原-抗体复合物与底物溶液接触时,酶能够催化底物分解,产生颜色变化。通过测量颜色的变化程度,可以判断待测抗原或抗体的浓度。
样品收集、处理及保存方法
1. 血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000 转离心 10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心 30 分钟取上清。
3. 细胞上清液:3000 转离心 10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心 10 分钟取上清。
5. 保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解 冻并确保样品均匀地充分解冻。
准备工作
1.孔板室温平衡1小时
2.做好布板图谱
3.样本解冻
4.准备各型号的移液枪、枪头、量筒
5.准备双蒸水
6.根据样本量配好样本稀释液
7.根据样本量及洗板次数配好洗液
8.若需要提前设置好振板器、洗板器
9.准备足够量的擦手纸
10.根据说明书提示,溶解标准品
11.配制不同浓度的标准品
12.配制质控品
13.根据预实验结果稀释样本
14.准备好封板膜
操作步骤
1. 包被:将抗原溶液加入聚苯乙烯酶标板孔中,包被抗原,37℃孵育1小时。
2. 清洗:清洗酶标板,去除未结合的抗原和其他杂质。
3. 阻断:加入阻断液,37℃孵育30分钟,以封闭酶标板上的非特异性结合位点。
4. 清洗:清洗酶标板,去除未结合的阻断液和其他杂质。
5. 加样:加入标准品和待测样本,37℃孵育1小时。
6. 清洗:清洗酶标板,去除未结合的蛋白质。
7. 加酶标抗体:加入酶标记的抗体,37℃孵育1小时。
8. 清洗:清洗酶标板,去除未结合的酶标抗体。
9. 显色:加入TMB底物溶液,37℃孵育15-30分钟。
10. 终止反应:加入终止液,停止显色反应。
11. 检测:在450nm波长下读取吸光度值(OD值)。
注意事项
1. 实验前请仔细阅读本试剂盒的使用说明,确保所有材料、器具和试剂准备齐全。
2. 为保证实验结果的准确性,请务必遵循实验步骤进行操作,并注意控制实验条件的一致性。
3. 实验过程中请勿触摸酶标板上的酶标抗体区域,以免影响实验结果。
4. 实验结束后请及时清洗并整理实验器具,避免交叉污染。
5. 本试剂盒仅供体外诊断使用,使用前请仔细阅读说明书,如有疑问请及时联系厂家或专业技术人员。
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免责声明
试剂盒仅供研究使用,不得用于临床实验或生物体实验,否则所产生的一切后果,由实验者承担, 本公司概不负责。
严格按照说明书操作,不同批号不可交换使用,实验者违反说明书操作,后果由实验者承担
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文献和实验标本的采集及保存
1.血清:全血标本请于室温放置2小时或4℃过一晚后于1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
2.血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
3.细胞培养物上清或其它生物标本:1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。 (注:标本溶血会影响**检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。)
标本的稀释原则:首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量,确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内,检测的结果才是准确的。稀释的过程中,应做好详细的记录。计算浓度时,稀释了“N”倍,标本的浓度应再乘以“N”。
标准品的稀释原则:2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为300 pg/ml,做系列倍比稀释后,分别稀释300 pg/ml,150 pg/ml,75 pg/ml,37.5 pg/ml,18.5 pg/ml,9 pg/ml,4.5 pg/ml,样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/ml,临用前15分钟内配制。 如配制150 pg/ml标准品:取0.5ml(不要少于0.5ml)300 pg/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。
生物素标记抗体的稀释原则:临用前以生物素标记抗体稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素标记抗体加990μl生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。
辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则:临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。
操作步骤
实验开始前,请提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时,用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。
1.加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl,余孔分别加标准品或待测样品100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应120分钟。 为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。
2.弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl(取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制),37℃,60分钟。
3.温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干。
4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液) 100μl,37℃,60分钟。
5.温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干。
6.依序每孔加底物溶液90μl,37℃避光显色(30分钟内,此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔梯度不明显,即可终止)。
7.依序每孔加终止溶液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后15分钟以内进行检测。
注意事项
1.用户在初次使用试剂盒时,应将各种试剂管离心数分钟,以便试剂集中到管底。
2.每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是加底物溶液及2N 。测量时先用此孔调OD值至零。
3.为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜。
4.未使用完的酶标板或者试剂,请于2-8℃保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液或、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。
5.建议检测样品时均设双孔测定,以保证检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟。根据需要,重复此过程数次。
自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
计算
以标准物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
注意事项
1.当混合蛋白溶液时应尽量轻缓,避免起泡。
2.洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。
3.一次加样时间**控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
4.请每次测定的同时做标准曲线,做复孔。
5.如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请乘以稀释倍数。
6.在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。
7.底物请避光保存。
8.不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。
注意事项:收集标本前必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天进行检测的标本,储存在4 ℃备用,如有特殊原因需要周期收集标本, 将标本及时分装后放在-20 ℃或-70 ℃条件下保存。避免反复冻融。标本2 -8 ℃可保存48 小时,-20 ℃可保存1 个月。-70度可保存6 个月。部分激素类标本需添加抑肽酶。
计算:以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
试剂盒性能
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。
2.批内与批见应分别小于9%和15%
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