5、蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解,蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含7种独立的蛋白酶抑制剂;每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性,包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
1. 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
2. 实验过程中的所有试剂须预冷;所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
3. 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀,不影响使用,溶解后正常使用。
4. 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
5. Western 实验内参可以选用Lamin A、Lamin B、TBP、Histon H3。
1. 提取液制备:每 200ul 冷的蛋白提取液A 和B 中分别加入2ul 蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂,混匀后置冰上备用。
2. 取 5-10×106 个细胞①,在4℃,500×g 条件下离心2-3 分钟,小心吸取培养基,尽可能吸干,收集细胞。
3. 用冷 PBS 洗涤细胞两次,每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 每 20ul 细胞压积中加入200μl 冷的提取液 A,高速涡旋振荡15 秒或吹打混匀,置冰上15 分钟,中间每隔5 分钟涡旋振荡或吹打混匀。
5. 再次高速涡旋振荡 5 秒,然后在4℃,12000×g 条件下离心5 分钟。
6. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到胞浆蛋白,请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
7. 沉淀用 PBS 洗涤一次,然后在4℃,12000×g 条件下离心5 分钟,弃上清。
8. 在沉淀中加入 200μl 冷的提取液B,高速涡旋振荡15 秒。
9. 置冰上 40 分钟,每隔10 分钟高速涡旋振荡15 秒。
10. 在 4℃,12000×g 条件下离心10 分钟。
11. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到核蛋白。
12. 将上述蛋白提取物定量②后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验③。
注:
① 细胞数量根据实验情况调整,每次的提取液用量并不是一定的,请根据实际情况调整。
② 建议用BCA 法进行蛋白定量。
③ 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉,不要被细菌污染。
组织蛋白提取
1. 提取液制备:每 200ul 冷的蛋白提取液A 和B 中分别加入2ul 蛋白酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用。
2. 取适量组织样本剪碎,加冷PBS,用组织匀浆器匀浆①至无明显肉眼可见固体(或用液氮研磨),冰上静置5 分钟,小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。
3. 在 4℃,500×g 条件下离心2-3 分钟,弃上清。
4. 每 20ul 细胞压积中加入200μl 冷的提取液 A,高速涡旋振荡15 秒或吹打混匀,置冰上15 分钟,中间每隔5 分钟涡旋振荡或吹打混匀。。
5. 再次高速涡旋振荡 5 秒,然后在4℃,12000×g 条件下离心5 分钟。
6. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到胞浆蛋白,请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
7. 沉淀用 PBS 洗涤一次,然后在4℃,12000×g 条件下离心5 分钟,弃上清。
8. 在沉淀中加入 200μl 冷的提取液B,高速涡旋振荡15 秒。
9. 置冰上 40 分钟,每隔10 分钟高速涡旋振荡15 秒。
10. 在 4℃,12000×g 条件下离心10 分钟。
11. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到核蛋白。
12. 将上述蛋白提取物定量②后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验③。
注:
① 用液氮研磨的方法更佳。
② 建议用BCA 法进行蛋白定量。
③ 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉,不要被细菌污染。
使用本产品的文献:
● Guang Yu, Tonghai Yan et al. Ser9 phosphorylation causes cytoplasmic detention of
I2PP2A/SET in Alzheimer disease
Neurobiology of Aging 2013 (IF=6.189)
● Xiaoling Ma et al. Staphylococcal Panton-Valentine Leukocidin Induces
Pro-Inflammatory Cytokine Production and Nuclear Factor-Kappa B Activation in Neutrophils
PloS one 2012 (IF=4.411)
● Jinchun Qian et al. Ophiopogonin D prevents H2O2-induced injury in primary human
umbilical vein endothelial cells
Journal of Ethnopharmacology 2010 Volume 128, Issue 2, Pages 438-445 (IF=2.466)