含 EmGFP 的 BLOCK-iT™ Pol II miR

含 EmGFP 的 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒兼具了传统 RNAi 载体的优势（稳定表达和使用病毒递送的能力）与组织特异性表达和同一转录本中多次靶标基因敲低能力。包括在含 EmGFP 的 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒中的 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR 载体设计用于表达人工 miRNA，其经基因工程改造后与靶序列具有 100% 同源性，将导致靶标切割。该载体包括来自内源性 miRNA 的侧翼和环序列，其指导从较长的 Pol II 转录本（miRNA 前体）中切除基因工程改造 miRNA。使用 Invitrogen 优质 BLOCK-iT™ RNAi Designer，70% 以上的构建体产生超过 70% 的敲低。基因工程改造 miRNA 的 Pol II 表达可实现：
o CMV 立即早期启动子的强表达，可选择通过 MultiSite Gateway™ 重组使用组织特异性或其他调节启动子
o pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR 载体中祖母/绿 GFP (EmGFP) 报告基因的同-顺反子表达，使 EmGFP 的表达与目的 miRNA 敲低活性之间具有极强的相关性
o 与许多用于基因表达的 Invitrogen Gateway™ 目的 (DEST) 载体兼容；包括用于稳定转导分裂、非分裂和原代细胞类型的慢病毒载体、用于单位点染色体整合的 Flp-In™ 系统以及替代报告基因融合构建体
o 在同一转录本上表达一个以上的基因工程改造 miRNA，允许同时敲低多个基因并产生合成表型
工作原理
对于 miR RNAi 序列的高水平表达，pcDNA™6.2-GW/miR 载体包括 CMV 启动子（图1）。只需在免费的在线 BLOCK-iT™ RNAi Designer 中输入 RefSeq 登录号或核苷酸序列，该软件即可设计出与目标靶标具有 100% 同源性的优化 miRNA。使用快速连接方案将 miRNA 克隆至载体中并进行转染，以立即表达 miRNA。表达的 miRNA 在细胞核中通过内源性细胞机制（包括 Drosha）加工，然后转运至细胞质中，在细胞质中通过 Dicer 进行进一步加工（图2）。然后将完全加工的 miRNA 掺入 RISC 中，在后者中其功能类似于 siRNA，并可导致 mRNA 靶标切割。
对于多种表达选项，miRNA 盒（含有 EmGFP、miR 侧翼区和与目标靶标同源的 miRNA）可轻松地转移至多种 DEST 载体中。这通过 Gateway™ 重组反应发生，在该反应中，将 miRNA 盒转移至 pDONR™ 载体中（BP 反应），然后转移至DEST 载体中（LR 反应）。