猪肿瘤坏死因子α(TNF-α)检测试剂盒

ELISA实验中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。完整的猪肿瘤坏死因子α(TNF-α)检测试剂盒应该包含以下各组分：
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；
（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；
（3）酶的底物；
（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；
（5）结合物及标本的稀释液；
（6）洗涤液；
（7）酶反应终止液。
一、免疫吸附剂
已包被抗原或抗体的固相载体在低温（2~8℃）干燥的条件下一般可保存6个月。有些不完整的试剂盒，仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行包被。以下简述固相载体和包被过程。
猪肿瘤坏死因子α(TNF-α)检测试剂盒实验步骤
一、预试验
（一）抗体包被的酶标板的制备
1.以碳酸盐缓冲液将抗体稀释成适当浓度（参考：5ug/ml），加入酶标板（50ul/孔），以胶带封口，于4℃过液。
2.弃抗体液，以双蒸水冲洗3次，自然干燥后以胶带封口。此为由已知抗体包被的酶标板，备用。
（二）底物浓度的摸索
在底物缓冲液中加入不同量的底物（参考：5mg/10ml），加入酶标板中（50ul/孔），以胶带封口，37℃避光保存2h，在没有明显变色的条件下选择尽可能大的底物浓度。
（三）酶标抗原浓度的摸索
选择明确为阴性的标本，加至已包被抗体的酶标板中（50ul/ 孔）；用稀释液稀释酶标抗原至适当倍数（参考：40~4000倍），同时加入酶标板中（50ul/ 孔），混合后封口后于37℃作用30min。以洗液连续冲洗5次，然后于吸水纸上拍干，加入已摸索好的底物封口后于37℃作用30min，在保持有明显变色的条件下选择尽可能小的酶标抗原浓度。
二、猪肿瘤坏死因子α(TNF-α)检测试剂盒正式试验
1. 以稀释液将待检标本做适当稀释（预试中确定）加入包被有已知抗原的酶标板中（50ul/孔），加封口胶带于37℃作用30min。
2. 弃反应液，以冲洗液连续洗板5次并于吸水纸上拍干。
3. 加入酶标抗体（浓度在预试中确定）。加封口胶带后于37℃作用30min。
4. 重复第2步。
5. 加底物（浓度在预试中确定），加封口胶带后于室温下避光作用5-60 min，其间不时观察，显色满意后加终止液50ul/孔。
6. 于酶标仪测定OD值，OPD用492nm测定，TMB用450nm测定。
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