细胞转染

产品简介：
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

二．简要步骤：
1、慢病毒转染贴壁细胞实验方法
（1）慢病毒转染前18-24h，将贴壁细胞以1×10⁵个/ml铺到6孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10⁵个/ml左右。
（2）次日，用含有6 μg/ml polybrene的1ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。37℃孵育。
（3）（对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤）8h-16h后，观察转染情况，更换新鲜培养基1ml/孔，37℃培养。
（4）如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。
2、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
（1）在2×10⁵个/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。37℃孵育。 如果该细胞株不易受慢病毒感染，可以使用离心孵化的方法。即在细胞培养板上加入病毒感染液后在离心机上以2500rpm(1000-1500g)在32℃或者室温下离心90min。
（2）（对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤）8h-16h后，观察转染情况，更换新鲜培养基1ml/孔（6孔板），37℃培养。
（3）继续培养1-3天。中间视细胞生长情况可传代或换液。
三．转染效果图：

四．常见问题分析：
1、慢病毒对目的细胞的感染效率很低，如何提高病毒的感染效率？
首先要保证细胞在感染之前处于良好的生长状态，提前24小时在细胞板上铺好细胞。其次可以使用易感细胞如293T进行滴度测试，检测慢病毒浓缩液滴度是否出现大幅下降。在此基础上适当提高慢病毒感染的MOI值和延长感染时间。另外，还可以选择在培养基中添加polybrene或更换为Fitransfer培养基。
2、加入慢病毒后，目的细胞状态很差或出现大量死亡，原因是什么？如何解决？
无论是用真核表达质粒转染还是用慢病毒感染，在引入宿主细胞时均可能引发细胞的毒性反应，如果所选择的宿主细胞系对慢病毒感染很敏感，则会出现严重的生理异常或死亡。针对这种情况有以下几点解决方法：首先要在感染之前保证细胞处于良好的生长状态；二是要适当降低感染的MOI值，以降低细胞的毒性反应；三是要根据细胞反应，在感染后4~12h为细胞换液，并观察细胞的反应。
3、如何评估慢病毒的感染效率呢？
我们构建的慢病毒载体常常带有荧光标记基因（如GFP等），因此可在感染后1~3天后观察到荧光，可以用显微镜观察或流式细胞仪检测阳性细胞的数量；另外，还可以利用Real-time PCR检测宿主细胞中的慢病毒载体拷贝数，以评估慢病毒的感染效率。
4、如何确定选择的宿主细胞能否被慢病毒感染?
由于慢病毒是一种经过改造的特殊逆转录病毒，它的感染谱很广，分裂细胞和非分裂的细胞均可以被感染。因此在实验前应该先查找相关文献，了解慢病毒感染这种宿主细胞的大致条件；但是由于很多细胞系并没有这方面的研究基础，因此在正式实验之前需要进行慢病毒感染预实验，即用空的带荧光标记的慢病毒来感染选定的宿主细胞，根据细胞是否可观察到荧光，来判断外源基因是否已经在宿主细胞内表达了。
5、稳定细胞株筛选的药物浓度如何确定？
在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素筛选稳定细胞系细胞之前，需要先通过梯度实验确定适合该类细胞的最佳药物浓度。对于一些常见的细胞系，通常可以在文献等资料中找到推荐的药物浓度。用G418或潮霉素B，选用在5天左右出现细胞大批死亡，2周全部死亡的浓度作为筛选浓度。对于嘌呤霉素,通常采用在3-4天杀死全部细胞的浓度。不同批次的药物活性有一定差异。因此在使用新批次药物时，需要重新测定最佳浓度。


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