5’末端DNA探针同位素（[γ32P]ATP）激酶标记试剂盒

我做NF-kB的EMSA实验方法和结果，条带不好，请大家指点！

。 （7）吸取上清，为核蛋白提取物。 （8）马上进行EMSA实验。 探针制备： 用γ-32P-ATP及T4多核苷酸激酶对合成的转录因子结合和突变型寡核苷酸的两条互补链分别进行末端标记。20 µl反应总体积中，加寡核苷酸10 pmol，10×T4多聚核苷酸激酶缓冲液2µl，γ-32P-ATP 3 pmol，T4多核苷酸激酶10 u，37 ℃反应45 min，再置于68 ℃ 10 min灭活。在离心管中加入退火反应液60 µl，互补配对的两条链的标记产物各20 µl，于95 ℃变性5min，缓慢降温

分子杂交技术（二）

粘膜端，在反应中只加入[α-32P]dNTP或[α-32P]dGTP，使可选择性标记两末端之一。 　　3．用T4多核苷酸激酶标记DNa 5’末端　寡核苷酸探针或短的RNA和DNA探针可选用此法标记，寡核苷酸探针一般多用这种标记。T4多核苷酸激酶（polynucleotide kinase, PNK）是由T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，此酶能催化ATP的γ-磷酸转移至DNA或RNA的5’－OH末端。在过量ADP存在时，也可促进磷酸交换反应，使PNK将DNA末端5’磷酸转移到ADP上生

核酸探针的常用酶促标记技术

的RNA和DNA探针可选用此法标记，寡核苷酸探针一般多用这种标记。T4多核苷酸激酶（polynucleotide kinase, PNK）是由T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，此酶能催化ATP的γ-磷酸转移至DNA或RNA的5’－OH末端。在过量ADP存在时，也可促进磷酸交换反应，使PNK将DNA末端5’磷酸转移到ADP上生成ATP，然后催化[α-32P]dNTP上的标记磷酸转移至DNA的5’末端，从而使DNA重新磷酸化，并藉此得到标记。显然，PNK标记DNA末端需要[γ-32P]dNTP，这与前述