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表观组测序 Bisulfite甲基化测序
上海惠研生物科技有限公司
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表观组测序 Bisulfite甲基化测序
DNA甲基化是重要的表观遗传学标记信息,获得全基因组范围内所有C位点的甲基化水平数据,对于表观遗传学的时空特异性研究具有重要意义。我们以新一代高通量测序平台为基础,结合全基因组Bisulfite处理和生物信息数据分析技术,进行低成本、高效率、高准确度的全基因组DNA甲基化水平图谱绘制。特定物种的高精确度甲基化修饰模式的分析,必将在表观基因组学研究中具有里程碑式的意义,并为细胞分化、组织发育等基础机制研究,以及动植物育种、人类健康与疾病研究奠定基础。
重亚硫酸盐转换原理
重亚硫酸盐(HSO3-)可将未甲基化C转换为U,但不能讲甲基化C转变为T。
DNA测序技术在重亚硫酸盐处理样本前后对DNA基因组进行测序,经前后序列比对可判别甲基化状态
采用EZ DNA Methylattion-Gold kit进行Bisulfite处理
EZ DNA Methylation-Gold Kit是EZ DNA Methylation Kit的改进版。EZ DNA Methylation-Gold Kit将DNA变性过程和亚硫酸氢盐转化过程合成一步,使整个过程更快,可在3小时内完成。此步骤采用温度变性来取代之前方案中使用的化学变性过程。转化之后,试剂盒可回收75%以上的DNA。
试剂盒的设计可以减少模板降解和纯化过程中的DNA损失,并且完全转化未甲基化的胞嘧啶,转化效率在99%以上。回收的DNA对于PCR扩增、限制性内切酶消化、测序、芯片等下游分析是很理想的。
若你的样品量很少,Zymo还提供了另外一个好选择——EZ DNA Methylation-Direct Kit。它能够彻底转化来自血液、组织、细胞、FFPE和LCM样品中的DNA,而事先无需纯化。这款试剂盒的灵敏度更高,即使10个细胞或50 pg DNA也能对付,DNA回收率在80%以上。与EZ DNA Methylation-Gold Kit一样,DNA变性和亚硫酸氢盐转化是一步完成的。
检测精度高:单碱基分辨率,精确分析每一个C碱基的甲基化状态;
效率高,耗时少:借助新一代高通量测序平台,对全基因组5mC信息进行高效扫描;
性价比高:相对于传统PCR+Sanger测序方法,费用少。
1. 样品要求
样品类型: DNA 样品;
样品需求量(单次):10~30μg
样品浓度:≥ 30 ng/μL;
样品纯度:OD260/280 =1.8~2.0。
其他注意事项:
1) 采用QUBIT 对 DNA样品进行检测,最终DNA量以检测结果为准;
2) 若DNA总量超过样品要求,可以进行样品备份;
3) 项目完成后,将不再保存剩余样品。
2. 测序策略
HiSeq 测序平台,PE 2X100;
3. 项目执行周期
1Gb以下基因组,样本量小于10个,每个样本10X基因组覆盖度的数据,标准流程的运转周期约为50个工作日;
样本数量更多时,项目的运转周期根据项目的规模而定。
1. Bisulfite测序序列与参考基因组比对;
2. 测序深度和覆盖度分析:C碱基有效测序深度的累计分布统计和不同reads测序深度下的基因组覆盖度;
3. C碱基甲基化水平评估:C、CG、CHG和CHH平均甲基化水平;
4. 全基因组甲基化水平分布趋势:
1) 甲基化C碱基中CG、CHG和CHH的分布比例;
2) CG、CHG和CHH中的所有C的甲基化水平;
3) 各条染色体、不同基因区域和不同基因元件区域中CG、CHG和CHH中C的甲基化水平;
4) CHG和CHH中甲基化C附近10 bp的序列特征分析;
5) 全基因组甲基化图谱:染色体水平的甲基化C碱基密度分布,不同基因组区域和转录元件中的DNA甲基化水平;
6) 差异性甲基化区域分析(DMR)。
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