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- 2025年10月09日
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测定的实施中，应力求各个步骤操作的标准化，下面以板式ELISA为例，介绍有关注意事项。
（一）加样
在人E选择素(SELE)ELISA试剂盒中除了包被外，一般需进行45加样。在定性测定中有时不强调加样量的准确性，例如规定为加样一滴。此时应该使用相同口径的滴管，保持准确的加样姿势，使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中则加样量应力求准确。标本和结合物的稀释液应按规定配制。加样时应将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出现气泡。
（二）保温
在ELISA中一般有二次抗原抗体反应，即加标本后和加结合物后，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。各ELISA板不应叠在一起。为避免蒸发，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。湿盒应该是金属的，传热容易。如用保温箱，空湿盒应预先放在其中，以平衡温度，这在室温较低时更为重要。加入底物后，反应的时间和温度通常不做严格要求。如室温高于20℃，ELISA板可避光放在实验台上，以便不时观察，待对照管显色适当时，即可终止酶反应。
（三）洗涤
洗涤在人E选择素(SELE)ELISA试剂盒过程中不是反应聚，但却是决定实验成败的关键。洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯待塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的。因此在ELISA测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。在标本和结合物的稀释液和洗涤液中加入聚山梨酯（吐温，Tween）一类物质即右达到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，为非离子型的表面张力物质，常作为助溶剂。根据脂肪酸的种类而对聚山梨酯编号，结合月桂酸的为聚山梨酯20，在人E选择素(SELE)ELISA试剂盒中最为常用。它的洗涤效果好，并具有减少非特异性吸附和增强抗原抗体结合的作用。
洗涤如不彻底，特别在最后一次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。另外，在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净，也将与酶标抗体作用而产生干扰。
（四）比色
如阴性对照颜色极浅，在定性测定中一般可采用目视比色。如用比色计测定结果，准确性决定于ELISA板底的平整与透明度和比色计的质量。
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文献和实验多采用双抗体夹心ELISA，研究最多的选择素家和免疫球蛋白超家族。前者有E、L、P三型，均可见血液中。溶血性尿毒症和血小板减少性紫癜患者血液中，P选择素比正常人高2～3倍，而败血症、HIV感染和艾滋病患者血液中L选择素明显增高。血液中存在可溶性E选择素是内皮细胞激活的证据，败血症、糖尿病等患者血液中E选择素水平增高，一般与疾病的活动性无关，而与器官受损程度相关。如败血症患者，可溶性E选择素可增高20倍以上，据称与疾病的严重性或预后有关。肝炎、肝硬化等患者血液中超免疫球蛋白家族中ICAM
，在FACS仪上可同时检测有两种不同的细胞粘附分子。3．酶免疫测定法主要为双抗体夹心ELISA，本法应用最广，但仅能检出一群细胞的表面粘附分子数量，而不能反映单个细胞粘附分子数量的变化。 二、可溶性粘附分子的检测 多采用双抗体夹心ELISA，研究最多的选择素家和 免疫球蛋白 超家族。前者有E、L、P三型，均可见血液中。溶血性尿毒症和血小板减少性紫癜患者血液中，P选择素比正常人高2～3倍，而败血症、HIV感染和艾滋病患者血液中L选择素明显增高。血液中存在可溶
1/Th2关系的研究进展较快。CCR3［16］、CCR4［17］选择性表达在人类或小鼠的Th2细胞，CCR5［18］、CXCR4［19］选择表达在 Th1细胞。也有报道膜表面IFN-γ受体β链可选择性地表达在 Th1细胞［20］。 二、Th1/Th2细胞的鉴定 尽管目前提出了较多的 Th1/Th2细胞表面标志，但根据淋巴细胞因子谱的异同识别Th1和Th2细胞仍然是目前最有效的手段，特别是细胞内因子标记的流式细胞技术。近来由于细胞因子ELISA试剂盒的不断涌现，为研究Th1/Th2细胞因子谱
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