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- Fermentas
- K0222
- 2025年07月15日
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- 文献和实验
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- 规格：
1,000 x 25 µL rxns
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文献和实验PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束
几个复孔，选择重复性好的 CT 值参与计算。 （2）CT＜30，重复性较差。这种情况一般同操作有关。 解决办法：从以下几个方面进行问题的排查：①加样准确度；②移液器吸取液体的准确度；③定期校准 qPCR 仪。 ①加样准确度 避免小体积加样，减少加样误差。可以将引物、SYBR Green Mix、ddH2O 配置成混合体系，并且增加模板的稀释梯度，大体积加样。如：原液 cDNA 添加 1μl，可以更改为原液 cDNA 稀释 5 倍，添加 5μl，使用 ddH2O 补齐体系至 20μl 即可
时发现，这个实验其实是有扩增的，但原本应该平直的 ROX 荧光曲线却呈现出一个跟 SYBR 颠倒对称的图形（图 12B）。我们查看 Raw data 时发现其第一通道荧光（FAM）是正常上升的，第四通道荧光（ROX）也是维持在正常水平，这就怀疑可能与校准文件异常有关。这台仪器在重新做了 SYBR 荧光校准以后，扩增曲线就恢复正常了，也能得到正常的 CT 值。 图 12 校准文件异常导致曲线异常 关于扩增曲线异常的更多案例分析可以参考我们之前的推文《荧光定量 PCR 异常扩增曲线分析攻略
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