检测修饰性PEG和PEG修饰蛋白的ELISA试剂盒

应用： 此试剂盒只用于科研，不可用于诊断或治疗

产品介绍：
治疗蛋白通过结合mPEG链以PEG化，蛋白PEG化后可通过减缓蛋白水解和从循环系统中清除的速率来延长半衰期，因此可以增加其疗效（refs.1&2）。mPEG化蛋白的药效学通常情况下应用对多肽链的特异性分析进行评估。但这些方法需要消耗大量时间，且建立目标蛋白的ELISA非常昂贵。mPEG ELISA试剂盒可以检测mPEG链，因此适合评估mPEG化生物制剂和mPEGs的药效学。

分析试剂盒基于夹心ELISA原理，它应用了两个抗-PEG小鼠单克隆抗体。针对PEG的聚乙二醇主链的特异性抗体包被在96孔板上，用于捕获。另一专一性抗体用于特异性结合结合了辣根过氧化物酶的mPEG的末端甲氧基，进行检测。

此ELISA试剂盒可用于检测游离mPEG（图1）和带有一个或多个mPEG链的mPEG化蛋白（图2）。然而，它不能检测缺少末端甲氧基的PEG链。试剂盒的灵敏度随着mPEG链的长度而变化，因此mPEG或mPEG化的分子应该产生一个标准曲线。研究表明此试剂盒可识别分子量大于等于2kDa的mPEG。试剂盒提供5kDa mPEG-氨的标准品，可方便用户去检测试剂盒的性能。

分析方法：
首先将100ul的HRP抗-mPEG加入到微孔板中，然后加入100ul的稀释样品和标准品，在微孔板振荡器上混匀1小时。冲洗微孔以后，加入100ul的TMB到微孔中，孵育20分钟，结果会产生蓝色。加入1N HCL 100ul终止反应，蓝色会变为黄色，检测其在450nm处的吸光值。mPEG的浓度从标准曲线上获得。

试剂盒包含以下内容：
抗-PEG包被的96孔板（12个可拆开的条，每条8孔），在-20℃下储存
HRP 抗-mPEG复合物，25ul（1瓶）。在-20℃下储存
mPEG稀释液，50ml
5kDa mPEG-氨标准品，100ul（1瓶）。在-20℃下储存
mPEG清洗缓冲液，60ml
TMB试剂，11ml
终止液，11ml

需提供以下试剂或耗材：
移液器和枪头
蒸馏水或去离子水
聚丙烯或玻璃管
漩涡混合器
微孔板振荡仪（混合速度，150转/分钟）
平板垫圈
在450nm处光密度在0-4的平板阅读器
绘图软件

标准液的制备：

1. 标记8支聚丙烯管或玻璃管，浓度为20,10,5,2.5,1.25,0.625，0.3125和0ng/ml
2. 制备20ng/ml的标准品，标记在5kDa mPEG标准品标签上
3. 加入250ul的稀释液到管中，标记为10,5,2.5,1.25,0.625,0.3125和0ng/ml
4. 吸取250ul的20ng/ml mPEG标准品到管子中，标记10ng/ml，并混合。此试剂盒提供10ng/ml PEG-BSA标准品。
5. 通过连续稀释相同地制备5,2.5,1.25,0.625和0.3125ng/ml的标准品

分析过程：

1. 保护支持板上合适数量的包被孔
2. 加入100ul的HRP 抗-mPEG复合物到孔中
3. 吸取100ul标准品和样品到孔中（建议标准品和样品分别一式三份）
4. 在150转每分钟的微孔板振荡器上室温（25℃）孵育1小时
5. 使用一个平板垫圈，清洗孔6次，每孔加入400ul的清洗液
6. 吸取100ul的TMB试剂到每个孔中
7. 在150转/分钟的微孔板振荡器上轻轻地混合20分钟
8. 加入100ul的终止液到每个孔中终止反应
9. 轻轻混合直到蓝色变为黄色
10. 5分钟内读取450nm处的吸收值

结果计算：

1. 读取参考标准品和样品在450nm处的平均吸光值
2. 用平均吸光值和浓度值做标准曲线，Y轴是吸光值，X轴是浓度
3. 用合适的模型和电脑绘图软件导入数据
4. 使用每个样品的平均吸光值来确定mPEG或mPEG化蛋白的浓度值
5. 浓度乘以稀释因子计算出血清或血浆样品中mPEG化蛋白的实际浓度
6. 如果样品的吸光度值不在标准曲线范围，样品需要重新稀释和检测

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