通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)

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产品名称：通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)

货号：RP1100

规格：50T/100T

保存：-20℃保存，避免反复冻融，复检期为 1年。

产品内容：

试剂盒组成	50 次	100次
M-MLV(200U/ul)	50ul	50ul×2
5×M-MLV Buffer	200ul	400ul
Oligo(dT)16(10uM)	100ul	200ul
RNasin(40U/ul)	25ul	50ul
dNTPs(10mM)	100ul	200ul
Taq Polymerase(5U/ul)	25ul	50ul
10×PCR Buffer	250ul	500ul
MgCl2(25mM)	200ul	400ul
RNase-free ddH2O	1ml	1ml×2
说明书	1 份	1 份

产品简介：
本试剂盒适用于各种 RNA制品的反转录反应以及随后的PCR扩增。它采用M-MLV进行反转录反应，能够获得较长的反转录产物。同时，在 20ul 反转录体系和 50ul PCR 反应体系中，还可以一次性得到足够量的 PCR 产物用于后续的克隆实验。
本试剂盒中配置的酶均为进口的酶。RT 酶采用进口的 M-MLV，所以 cDNA 更长，基因的信息保留得更完整！反转录过程中特异的 RNase抑制剂可有效降低由于外源 RNase污染而导致实验失败的风险。
本试剂盒使用方便、快捷，可广泛用于 cDNA克隆及目的基因检测等分子生物学实验。

操作步骤：
一、反转录反应
1、在冰浴的无 RNase 的离心管中加入如下反应成分：
1-5ug 总RNA或 50-500ng mRNA
2ul Oligo(dT)16或 2 pmole基因特异性引物
补RNase-free ddH2O至 14.5ul
2、70℃保温5min 后迅速在冰上冷却 2min，简短离心收集反应液后加入以下各组分：
4ul 5×M-MLV Buffer
1ul dNTPs
0.5ul RNasin
1ul M-MLV
3、42℃温浴60min，如果是用随机引物，请先将离心管置 25℃温浴 10min，再 42℃温浴 60min。
4、95℃加热5min 终止反应，置冰上进行后续实验或-20℃保存。
5、用RNase-free ddH2O将反应体系稀释到50ul，取2-5ul进行PCR反应。

二、PCR反应
1、按以下各组分配制 50ul PCR 反应体系：
10×PCR Buffer 5ul
MgCl2 4ul
dNTPs 1ul
上游引物（用户自备 10um） 1ul
下游引物（用户自备 10um） 1ul
RT 反应产物 2ul
Taq Polymerase 0.5ul
ddH2O x ul
Total Volume 50ul
2、混匀后短暂离心，PCR 仪扩增，琼脂糖凝胶电泳观察结果。

注意事项：
1、 用于 cDNA 合成反应的相关试剂和耗材尽可能用 DEPC 进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。
2、 试剂盒的各组分应在-20℃保存，避免反复冻融，有效期 12个月。
3、 RNA样品要避免反复多次冻融，应使 RNA在冰浴中处于融化状态。

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本试剂盒适用于各种 RNA制品的反转录反应以及随后的PCR扩增。它采用M-MLV进行反转录反应，能够获得较长的反转录产物。同时，在20ul反转录体系和50ul PCR反应体系中，还可以一次性得到足够量的PCR产物用于后续的克隆实验。本试剂盒中配制的酶均为进口的酶。RT酶采用进口的M-MLV，所以cDNA更长，基因的信息保留得更完整！反转录过程中特异的RNase抑制剂可有效降低由于外源RNase污染而导致实验失败的风险。本试剂盒使用方便、快捷，可广泛用于cDNA克隆及目的基因检测等分子生物学实验。

通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)产品简介
莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶（M-MLV RT）是一种RNA依赖的DNA聚合酶，能使mRNA（>5kb）转录为cDNA。M-MLV RT的RNase H活性相对于禽成髓细胞瘤病毒反转录酶较弱，更适合用来反转录较长的mRNA。M-MLV RT应用于以RNA为模板合成cDNA的第一条链。
注意：M-MLV RT的延伸性要低于AMV 反转录酶，因此要得到和用AMV 反转录酶一样产量的cDNA需加入更多单位的M-MLV反转录酶。
通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)使用方法
1）使用方法简介以用2mg总RNA为例。在无RNase离心管中，加入0.5mg引物至含总RNA的样品中，总体积不大于15ml。70℃，5分钟打开模板链形成的二级结构。立即放于冰上降温防止二级结构恢复，随后短暂离心使液体集中在离心管底。
2）加入以下成分到已退火后的引物-模板混合物中。
注意：不要改变引物的加入比率。
M-MLV 5×Reaction Buffer 5ml
dATP，10mM 1.25ml
dCTP，10mM 1.25ml
dGTP，10mM 1.25ml
dTTP，10mM 1.25ml
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 25 units
M-MLV RT 200 units
无核酸水至最后体积 25ml
3）轻轻混匀离心管，如果使用随机引物在37℃孵育60分钟，其他引物则42℃孵育。延伸温度在37～42℃之间最佳。
4）M-MLV RT 用于合成cDNA的第一链。往后的合成则需要根据需要自行设计引物再次合成。
通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)Buffer组成
M-MLV RT 5×Reaction Buffer
250mM Tris-HCl（PH 8.3 室温下）
375mM KCl
15mM MgCl₂
50mM DTT
通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)来源
大肠杆菌表达纯化
通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)保存条件
-20℃保存。避免经常冻融。