总蛋白细胞裂解缓冲液

蛋白质印迹（Western blot）实验方案

器上）2 小时。3. 4 ℃ 下在微型离心机中以 16000 × g 离心 20 分钟。轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中。弃去沉淀。二、样品制备1. 取出小部分 (50 μL) 裂解物，用于蛋白分析。确定每种细胞裂解物的蛋白浓度。2. 向剩余体积的细胞裂解物中加入等体积的 2× Laemmli 样品缓冲液。我们推荐采用以下方法来还原样品和使样品变性，除非在线抗体数据表指明应使用非还原和非变性条件。3. 还原和变性：在 100 ℃ 下将样品缓冲液中的每种细胞裂解物煮沸

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获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解 30 min，细胞裂解液于 4 ℃，最大转速离心 30 min 后取上清； 取少量裂解液以备 Western blot 分析，剩余裂解液加 1 μg 相应的抗体加入到细胞裂解液，4 ℃ 缓慢摇晃孵育过夜； 取 10 μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗 3 次，每次 3 000 rpm，离心 3 min； 将预处理过的 10 μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中 4 ℃ 缓慢摇晃孵育

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[3] 将细胞裂解物分离成 RIPA 可溶性和 RIPA 不可溶性组分，发现在两个组分中都可以检测到 TDP-43 的磷酸化片段。同样的，用 RIPA 缓冲液裂解小鼠 MEC 细胞时，磷酸化的 EGFR（pY-1068 EGFR）只在 RIPA 可溶性组分中检测出。然而，磷酸化的 c-Src（pY-416 c-Src）则在 RIPA 可溶性和 RIPA 不可溶组分中都能检测出， 甚至 WT 样品在 RIPA 不可溶组分中的信号比 RIPA 可溶性组分中更强（下图），结果表明如果仅使用 RIPA 可溶性组分